FITC (solution) 

FITC (Fluorescein Isothiocyanate) (solution) , is one of the green fluorescein derivatives widely used in biology. FITC has the characteristics of high absorptivity and excellent fluorescence quantum yield. The isothiocyanate group of FITC can be combined with amino, sulfhydryl, imidazole, tyrosyl, carbonyl and other groups on the protein, so as to achieve protein labeling including antibodies and lectins. In addition to its use as a protein marker, FITC can also be used as a fluorescent protein tracer to rapidly identify pathogens by labeling antibodies, or for microsequencing of proteins and peptides (HPLC). The maximum excitation wavelength of FITC is 494 nm. Once excited, it fluoresces yellow-green at a maximum emission wavelength of 520 nm. In addition, FITC is also a hapten that can induce contact hypersensitivity (CHS) and induce an atopic dermatitis model^[1][2][3][4].
Solvent and concentration: DMSO: 20 mM
The 1 mL volume is defined as the base specification. All larger sizes correspond to incremental volumes of this base.

原液制备

1. 蛋白准备
为了获得最佳标记效果，请将蛋白 (抗体) 浓度配制为 1 mg/mL。
1) 蛋白溶液 PH 值应为 8.5±0.5，若 pH 低于 8.0，则用 1 M 碳酸氢钠进行调整。
2) 若蛋白浓度低于 1 mg/mL，标记效率会大大降低，为了获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为 1-10 mg/mL。
3) 蛋白必须在不含伯胺 (如 Tris 或甘氨酸) 和铵离子的缓冲液中，否则会影响标记效率。
2. 染料准备
可根据实际情况稀释相应的储备液。注意，如果溶剂为 DMSO，则必须考虑 DMSO 的细胞毒性，并应制备溶剂对照；如果溶剂为纯水，则工作液在加入细胞前需要过滤并除菌。
注：FITC 要现配现用，避光。
3. 染料用量计算
标记反应所需的 FITC 用量取决于要标记蛋白的用量，FITC 与蛋白的最佳质量比为 1：50 左右。
例：假如所需标记蛋白为 1 mL，2 mg/mL 的 IgG (MW=150,000) ，用 1 mL DMSO 溶解一管 1 mg FITC，则所需 FITC 体积为 40 μL。
计算公式：
Molar F/P= (MW/389) * (A₄₉₅/195) /{[A₂₈₀- (0.35*A₄₉₅) ]/E^0.1%}= (A₄₉₅*C) /[A₂₈₀- (0.35*A₄₉₅) ]
C= (MW*E^0.1%₂₈₀) / (389*195)
注：
C：一种蛋白质常数； MW：蛋白质分子量； 389：FITC 的分子量； 195：FITC 偶联物在 pH=13, 490 nm 处的吸光值 E^0.1%； (0.35×A495) ：基于 FITC A280 的校正因子； E^0.1%：蛋白 (1.0 mg/mL) 在 280 nm 处的吸光值。

使用说明
1. 标记反应
1) 取算好体积的新鲜配制的 50 μL FITC 缓慢加入到 1 mL 蛋白样品溶液中，轻轻摇匀混合，然后短暂离心将样品收集在反应管底部。切忌剧烈混匀，防止蛋白样品变性失活。
2) 将该反应小管置于避光处，在室温条件下轻轻摇晃孵育 8 h，每隔 30 分钟，将反应小管轻轻颠倒几次，以充分混合两种反应物，提高标记效率。
3) 加入 5 M 的 NH₄Cl 至终浓度 50 mM，4°C 终止反应 2 h。
2. 蛋白纯化脱盐
以下方案以使用 Sephadex G-25 柱纯化染料蛋白偶联物为例。
1) 按照生产说明书制备 Sephadex G-25 柱。
2) 将反应混合物装入Sephadex G-25 色谱柱顶部。
3) 当样品运行到顶部树脂表面下方时，立即加入 PBS (pH 7.2-7.4)。
4) 向所需样品中加入更多的 PBS (pH 7.2-7.4) ，完成柱纯化。结合物含有所需要的染料-蛋白质缀合物的组分。

注意事项
1. FITC 对光及湿度敏感。即用即配 FITC 溶液并丢弃未使用的部分。
2. 低浓度的叠氮化钠 (≤3 mM 或 0.02％) 或硫柳汞 (≤0.02 mM 或 0.01％) 不会显著干扰蛋白标记；但是 20-50％ 的甘油会降低标记效率。
3. 避免使用含伯胺 (例如 Tris，甘氨酸) 或铵离子的缓冲液，它们与待标记蛋白竞争反应。
4. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

MCE has not independently confirmed the accuracy of these methods. They are for reference only.

389.38

C₂₁H₁₁NO₅S

3326-32-7

液体（密度：1.548±0.14 g/cm³）

Light yellow to yellow

Room temperature in continental US; may vary elsewhere.

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• [1]. Gao SG, et al. Phosphorylation of osteopontin has proapoptotic and proinflammatory effects on human knee osteoarthritis chondrocytes. Exp Ther Med. 2016 Nov;12(5):3488-3494. Epub 2016 Oct 5.  [Content Brief]

  [2]. Zhu X, et al. Ratiometric, visual, dual-signal fluorescent sensing and imaging of pH/copper ions in real samples based on carbon dots-fluorescein isothiocyanate composites. Talanta. 2017 Jan 1;162:65-71  [Content Brief]

  [3]. Shigeno T, et al. Phthalate ester‐induced thymic stromal lymphopoietin mediates allergic dermatitis in mice[J]. Immunology, 2009, 128(1pt2): e849-e857.  [Content Brief]