细胞毒性实验

膜完整性是最常用于检测体外培养的细胞是否死亡的主要特征。无活力或死亡细胞会失去膜完整性并允许其他不可渗透分子进入。可以通过测定分子穿过已渗漏且无法修复的细胞膜，进出细胞的运动来进行死细胞的检测。MTT 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜 (DMSO) 能溶解细胞中的甲瓒，在 490 nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。体外细胞毒性测试已成为药物发现的一个组成部分，因为它是一种表征新化学实体潜在毒性的方便、经济高效且可预测的方法。

MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。 它们仅供参考。

1．细胞培养

因细胞来源的不同，细胞孵育的方式也各有差别，具体内容可以参考本站内细胞培养专题

2．MTT法评估细胞毒性

2.1 MTT 溶液配置

• 称取 MTT 0.5 g，溶于 100 mL 的 PBS 溶解澄清，浓度为 5 mg/mL。

• 使用 0.2 µm 过滤器将 MTT 溶液过滤灭菌至无菌、避光容器中。

3．MTT甲瓒溶解液

3.1 使用 DMSO 直接溶解。

3.2 使用增溶溶解液：

• 选择合适的耐溶剂容器并在通风橱中工作。在 2% (v/v) 冰醋酸中制备 40% (v/v) 二甲基甲酰胺 (DMF)。

• 添加 16% (重量/体积) 十二烷基硫酸钠 (SDS) 并溶解。

• 调整至 pH=4.7

• 室温保存以避免 SDS 沉淀。如果形成沉淀，则加热至 37°C 并混合以溶解 SDS。

4．MTT 检测

4.1 在 96 孔板中加入细胞和测试化合物，最终体积为 100 µL/孔，孵育所需的暴露时间(具体过程见细胞培养)。

4.2 每孔添加 10 µL MTT 溶液，以达到 0.45 mg/ml 的终浓度，37°C 孵育 1-4 小时，弃上清，悬浮细胞需先离心。

4.3 将 100 µl DMSO 或者溶解溶液添加到每个孔中，振荡 10 min，使甲臜结晶物充分溶解，避免产生气泡。

4.4 使用酶标仪或者分光光度计在 490 nm 或者 570 nm处的吸光度测量。

5．计算公式

细胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)] × 100%

抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)] × 100%

As: 实验孔吸光度 (含细胞、培养基、MTT 溶液和药物溶液)；

Ac: 对照孔吸光度 (含细胞、培养基、MTT 溶液，不含药物)；

Ab: 空白孔吸光度 (含培养基、MTT 溶液，不含细胞、药物)。

1．细胞密度和药物浓度对实验结果影响很大。根据经验，建议铺板时每孔细胞个数在 4000 左右，给药时细胞密度控制在 30% 左右。孔底的细胞一定要均匀分布。

2．使用 96 孔板进行检测时，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。

3．MTT 需要避光保存，实验时，建议快速操作，可以暂时不用避光。

4．溶液中避免含有硫醇的化合物，其会将 MTT 转化为 Formazan，从而会获得假阳性数据。

5．培养基中含有酚红也可能会影响实验结果。

6．加 DMSO 前要把液体吸干净，否则沉淀会很难溶解。