基因上不会有棉较限制酶的酶切位点吗？

是有可能的。所以在设计克隆和酶切以前都要考虑到这种情况。
在克隆的时候，基因两端加的限制性内切酶的位点必须是基因中间序列所没有的。这样克隆完成后再酶切，就没有这个顾虑了。
有些特例，就是无论怎么设计，基因序列当中都有酶切位点，这是在做酶切的时候，就进行不完全酶切（酶的量减少，反应时间缩短）。这样，有一部分中间位点就不会被切断，基因全长得以保留。