最佳答案
回答者：网友
这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其它序列退火的primer要符合下面的 一些条件 1) 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的primer同样会降低特异性,并且降低产量 2) GC% 40%~60% 3) 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性 4) 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GC (有人说：3' 端最好是 GC/CG/CC/GG。) 5) 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMER 6) 避免3'端的错配 7) 避免内部形成二级结构 8) 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们 9) 使用兼并primer时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并primer,并使用 较高的primer浓度(1uM-3uM) 10) 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online design et al.
