T3 RNA聚合酶（T3 RNA Polymerase）是一种来源于T3噬菌体的DNA依赖型RNA聚合酶，因其对特定启动子序列的高度专一性和高效的转录能力，已成为分子生物学研究中一种核心工具酶。T3 RNA聚合酶分子量约100 kDa，属于DNA指导的RNA聚合酶（DNA-dependent RNA polymerase）。它是一个功能强大的分子生物学工具。其核心价值在于高特异性与强正交性，能与T7、SP6等系统在多基因表达或复杂遗传线路构建中并行使用。同时，其标记核苷酸高效掺入能力，也使其成为制备高灵敏度RNA探针的理想选择。
基本特性
T3 RNA聚合酶通过基因工程手段在大肠杆菌（E. coli）中重组表达获得，保证其高产量和纯度。以含有T3启动子序列的单链或双链DNA为模板，以四种核糖核苷三磷酸（ATP、UTP、GTP、CTP）为底物，催化RNA链按5'→3' 方向合成。高度专一地识别T3噬菌体特有的23 bp保守启动子序列，这使其与T7、SP6等系统互不干扰。可高效掺入生物素、地高辛、荧光素等标记的核苷酸，用于制备各类标记RNA探针。在70℃加热10分钟或加入EDTA能使其失活。
动子识别与转录特性
T3 RNA聚合酶高度专一地识别T3噬菌体的特定启动子序列。该启动子的23 bp保守序列在不同启动子间高度保守，且其序列与T7启动子非常相似。识别核心：T3 RNA聚合酶对其启动子序列具有极高的特异性，严格区分于T7等异源启动子，这确保了转录系统的正交性。关键结构差异：决定其特异性的关键差异主要集中在启动子序列中至位附近。共识序列：T3启动子的共识序列为：AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA。加粗的G（+1位）是转录的起始核苷酸。转录起始位点（+1位）至+3位的碱基对转录效率至关重要，+1位必须是G，+2位和+3位必须为嘌呤碱基（A或G）。体外转录：在体外，T3 RNA聚合酶能高效转录T3基因组，其动力学特性显示，酶活性对底物GTP的浓度有较高依赖性。
T3 RNA聚合酶的核心应用
一、体外转录合成RNA，这是其最核心的用途。能以线性化质粒为模板，在体外高效合成大量未标记或标记的RNA，用于下游各类实验。
二、制备RNA探针，通过掺入放射性或非放射性标记的NTP，制备高比活度的RNA探针，用于Northern blot、Southern blot和原位杂交等。
三、生产功能性RNA分子，高效合成反义RNA（asRNA）、小干扰RNA（siRNA）和用于体外翻译的mRNA等。
四、研究RNA结构与功能，为RNA剪接、RNA二级结构、RNA-蛋白质相互作用等研究提供RNA底物。
五、基因调控与功能研究，利用合成的反义RNA在细胞内特异性抑制靶基因表达，用于基因功能研究。
六、高通量RNA合成，由于其单亚基结构简单，易与自动化平台整合，可用于规模化、高通量RNA合成。
注意事项
模板准备：用于体外转录的DNA模板必须是线性化的。应在目的基因下游的T3启动子后选择合适的限制性内切酶，将环状质粒完全切开。
反应体系：使用供应商提供的配套反应缓冲液。典型的反应体系包含线性化DNA模板、NTPs、RNase抑制剂和T3 RNA聚合酶。通常37℃孵育1-2小时即可获得高产量的RNA。
RNase污染：RNA极易被环境中无处不在的RNase降解。实验全程需使用无RNase的耗材和试剂，并建议在体系中加入RNase抑制剂。
T3 RNA聚合酶的改造
目前以 T3 RNA聚合酶为基础，为优化其性能，出现了更多改进型的生物技术方法。其中在《一种多用途RNA靶分子的制备方法》的专利中，选取待测RNA病毒对应的特定DNA目的片段，计包含 T7 及 T3 启动子序列的引物，在目的片段正链的 5'端 加上 T7 启动子序列，在负链的 5'端 加上 T3 启动子序列（或者也可以加 T7 启动子序列），人工合成上述含有启动子序列的DNA片段，并以此为模板，利用 T7 和/或 T3 启动子的引物序列进行 PCR扩增，获得大量的双链DNA分子。最后用以上述获得的DNA产物为模板，利用 T7 RNA聚合酶 和/或 T3 RNA聚合酶 进行转录扩增，最终获得单链或双链的 RNA靶分子[1]。
该方法可以在短时间内获得大量的特异性RNA靶分子片段。操作简便， 流程标准化。用途广泛， 制备的RNA靶分子可用于相关的检测或研究（如作为核酸检测的阳性对照等）。
参考文献
[1] 宜昌美光硅谷生命科技股份有限公司. 一种多用途RNA靶分子的制备方法：CN 116463396 A.2023.07.21.