DNA测序的方法有很多种. 目前最常见的是双脱氧终止法了. 在测序用的缓冲液中含有四种dNTP及聚合酶. 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸(称为ddA来自TP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), 然后进行聚合反应. 在第一个反应物中, ddATP会随机地代替dATP参加反应一旦ddATP加入了溶医眼解新留顾新合成的DNA链, 由于其3位的羟基变成了氢, 所以不能继续延伸. 所以第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了; 同理第二个反应产生的都孔你烟数持是以C结尾的; 第三个反应的都以G结尾, 第四个反应的都以T结尾, 电泳后就可以飞而较容秋读出序列了. 也许这样说你不一定明白. 举一个例子, 假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下:
在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的践买乎千冲是ddATP则终止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则子按县酸款少按首去吸明继续延伸, 可以产生序列GA台TCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以继续延伸, 产生GATCC防GAT.
所以在第一个反应进小系统中产生的都是以A采结尾的片段:
GA, GA德移加环久增景TCCGA,
同理在第律点二个反应中产生的都是以C结尾的片段:
GATC, GATCC,
在第三个反应中产生的都是以G结尾的片段:
G, GATCCG
在第四个反应中产生的都是以T结尾的片段:
GAT, GATCCGAT,
电泳时按分子量大小排列, A反应的片段长度为2, 7; C反应的为4, 5; G反应的为1, 6; T反应的错阶快破四害价么六为3, 8, 四个反应的产物分别电泳, 结果为
8 7 6 5 4 3 2 1
A | |
C | |
G | |
T | |
我们可以从右向左读, 为GATCCGAT, 至此, 测序完成
