细胞生物学

第九章 核糖体(ribosome)
?核糖体的类型与结构


?多聚核糖体与蛋白质的合成
第一节 核糖体的类型与结构
核糖体是合成蛋白质的细胞器，其唯一的
功能是按照mRNA的指令由氨基酸高效且精确
地合成多肽链。
?核糖体的基本类型与成分

?核糖体的结构

?核糖体蛋白质与rRNA的功能分析
一、核糖体的基本类型与成分
?核糖核蛋白体,简称核糖体(ribosome)
?基本类型
?附着核糖体
?游离核糖体
?70S的核糖体
?80S的核糖体
?主要成分
?r蛋白质：40%，核糖体表面
?rRNA:60%,，核糖体内部

二、核糖体的结构
?结构与功能的分析方法


?蛋白质合成过程中很多重要步骤
与50S核糖体大亚单位相关

结构与功能的分析方法
?离子交换树脂可分离纯化各种r蛋白；
?纯化的r蛋白与纯化的rRNA进行核糖体的重组装，
显示核糖体中r蛋白与rRNA的结构关系
?双向电泳技术可显示出E.coli核糖体在装配各阶段中，
与rRNA结合的蛋白质的类型
?双功能的交联剂和双向电泳分离可用于研究r蛋白在
结构上的相互关系
?电镜负染色与免疫标记技术结合，研究r蛋白在核糖
体的亚单位上的定位。
?对rRNA，特别是对16S rRNA结构的研究
?70S核糖体的小亚单位中rRNA与全部的r蛋白关系
的空间模型

?同一生物中不同种类的r蛋白的一级结构
均不相同，在免疫学上几乎没有同源性。


?不同生物同一种类r蛋白之间具有很高
的同源性， 并在进化上非常保守。

?蛋白质结合到rRNA上具有先后层次性。


?核糖体的重组装是自我装配过程

?16SrRNA的一级结构是非常保守的

?16SrRNA的二级结构具有更高的保守性：
臂环结构(stem-loop structure)

?rRNA臂环结构的三级结构模型
蛋白质合成过程中很多重
要步骤与50S核糖体大亚单位相关
?涉及的多数因子为G蛋白(具有GTPase活性)，核糖体上
与之相关位点称为GTPase相关位点。

?最近人们成功地制备L11-rRNA复合物的晶体，获得了
其空间结构高分辨率的三维图象。
?这一结果证实了前人用各种实验技术所获得的种种结论
?提出直观、可靠且比人们的预料更为精巧复杂和可能的
作用机制，从而为揭开核糖体这一具有30多亿年历史的
古老的高度复杂的分子机器的运转奥秘迈出了极重要的
一步。
三、核糖体蛋白质与rRNA的功能分析
?核糖体上具有一系列与蛋白质
合成有关的结合位点与催化位点


?在蛋白质合成中肽酰转移酶的活性研究
核糖体上具有一系列与蛋白质
合成有关的结合位点与催化位点
?与mRNA的结合位点
?与新掺入的氨酰-tRNA的结合位点——氨酰基位点，又称A位点
?与延伸中的肽酰-tRNA的结合位点——肽酰基位点，又称P位点
?肽酰转移后与即将释放的tRNA的结合位点——E位点(exit site)
?与肽酰tRNA从A位点转移到P位点有关的转移酶
(即延伸因子EF-G)的结合位点
?肽酰转移酶的催化位点
?与蛋白质合成有关的其它起始因子、延伸因子和
终止因子的结合位点
在蛋白质合成中肽酰转移酶的活性研究
?核糖体蛋白

?在核糖体中rRNA是起主要作用的结构成分

?r蛋白质的主要功能
核糖体蛋白
?很难确定哪一种蛋白具有催化功能：
在E.coli中核糖体蛋白突变甚至缺失对蛋白
质合成并没有表现出“全”或“无”的影响。
?多数抗蛋白质合成抑制剂的突变株，并非由
于r蛋白的基因突变而往往是 rRNA基因突变。
?在整个进化过程中rRNA的结构比核糖体蛋白
的结构具有更高的保守性。
在核糖体中rRNA是起主要作用的结构成分
?具有肽酰转移酶的活性；
?为tRNA提供结合位点(A位点、P位点和E位点)；?
?为多种蛋白质合成因子提供结合位点；?
?在蛋白质合成起始时参与同mRNA选择性地结
合以及在肽链的延伸中与mRNA结合；
?核糖体大小亚单位的结合、校正阅读(proofreading)、
无意义链或框架漂移的校正、以及抗菌素的作用等
都与rRNA有关。
r蛋白质的主要功能
?对rRNA 折叠成有功能的三维结构是十分重要的；

?在蛋白质合成中, 某些r蛋白可能对核糖体的构象
起“微调”作用；

?在核糖体的结合位点上甚至可能在催化作用中, 核
糖体蛋白与rRNA共同行使功能。
第二节 聚核糖体与蛋白质的合成
?多聚核糖体(polyribosome或polysome)

?蛋白质的合成

?RNA在生命起源中的地位及其演化过程
一、多聚核糖体
(polyribosome或polysome)

?概念
核糖体在细胞内并不是单个独立地执行功能，而是由多个
甚至几十个核糖体串连在一条mRNA分子上高效地进行肽
链的合成，这种具有特殊功能与形态结构的核糖体与
mRNA的聚合体称为多聚核糖体。

?多聚核糖体的生物学意义
?细胞内各种多肽的合成，不论其分子量的大小
或是mRNA的长短如何，单位时间内所合成的
多肽分子数目都大体相等。
?以多聚核糖体的形式进行多肽合成，对mRNA
的利用及对其浓度的调控更为经济和有效。
三、RNA在生命起源中的地位及其演化过程
?生命是自我复制的体系

?DNA代替了RNA的遗传信息功能

?蛋白质取代了绝大部分RNA酶的功能

生命是自我复制的体系
?三种生物大分子，只有RNA既具有信息载体
功能又具有酶的催化功能。因此，推测RNA
可能是生命起源中最早的生物大分子。

?核酶(ribosome)：具有催化作用的RNA。

?由RNA催化产生了蛋白质
DNA代替了RNA的遗传信息功能
?DNA双链比RNA单链稳定；


?DNA链中胸腺嘧啶代替了RNA链中的尿嘧啶，使之易于修复。
蛋白质取代了绝大部分RNA酶的功能
?蛋白质化学结构的多样性与构象的多变性；


?与RNA相比，蛋白质能更为有效地催化多种生化反应，并提供更为复杂的细胞结构成分，逐渐演化成今天的细胞。
第十章 细胞骨架(Cytoskeleton)

第一节 细胞质骨架

●微丝(microfilament, MF)

●微 管（microtubules）

●中间纤维（intermediate filament,IF)

●细胞骨架结构与功能总结
第二节 细胞核骨架
●核基质(Nuclear Matrix)

●染色体骨架

●核纤层(Nuclear Lamina )
一、微丝(microfilament, MF)
又称肌动蛋白纤维(actin filament), 是指真核
细胞中由肌动蛋白(actin)组成、直径为7nm的骨架纤维。
●成分
●装配
●微丝特异性药物
●微丝结合蛋白
●微丝功能
●肌肉收缩(muscle contraction)

成 分
●肌动蛋白(actin)是微丝的结构成分,外
观呈哑铃状, 这种actin又叫G-actin，将
G-actin形成的微丝又称为F-actin。

装 配
◆MF是由G-actin单体形成的多聚体，肌动蛋白单体具有极性,
装配时呈头尾相接, 故微丝具有极性，既正极与负极之别。
◆体外实验表明，MF正极与负极都能生长，生长快的一端为正
极，慢的一端为负极；去装配时，负极比正极快。由于G-actin
在正极端装配，负极去装配，从而表现为踏车行为。
◆体内装配时，MF呈现出动态不稳定性，主要取决于F-actin结
合的ATP水解速度与游离的G-actin单体浓度之间的关系。
◆ MF动态变化与细胞生理功能变化相适应。在体内, 有些微丝是
永久性的结构, 有些微丝是暂时性的结构。
微丝特异性药物
◆细胞松弛素(cytochalasins)：可以切断微丝,并结合
在微丝正极阻抑肌动蛋白聚合,因而导致微丝解聚。

◆鬼笔环肽(philloidin)：与微丝侧面结合,防止MF解聚。

◆影响微丝装配动态性的药物对细胞都有毒害，说明
微丝功能的发挥依赖于微丝与肌动蛋白单体库间的动
态平衡。这种动态平衡受actin单体浓度和微丝结合蛋
白的影响。
微丝结合蛋白
整个骨架系统结构和功能在很大程度上受到
不同的细胞骨架结合蛋白的调节。
◆ actin单体结合蛋白
这些小分子蛋白与actin单体结合，阻止其添加到
微丝末端，当细胞需要单体时才释放，主要用于actin
装配的调节，如proflin等。
◆微丝结合蛋白
◆微丝结合蛋白将微丝组织成以下三种主要形式：


?Parallel bundle: MF同向平行排列，主要发 现于微绒毛与丝状伪足。
?Contractile bundle: MF反向平行排列，主要
发现于应力纤维和有丝分裂收缩环。
?Gel-like network: 细胞皮层(cell cortex)中微丝
排列形式，MF相互交错排列。

微丝功能
◆维持细胞形态，赋予质膜机械强度
◆细胞运动
◆微绒毛(microvillus)
◆应力纤维(stress fiber)
◆参与胞质分裂
◆肌肉收缩(muscle contraction)

微丝遍及胞质各处，集中分布于质膜下，和其结合蛋白形成网络结构，维持细胞形状和赋予质膜机械强度，如哺乳动物红细胞膜骨架的作用。


成纤维细胞爬行与微丝装配和解聚相关

是肠上皮细胞的指状突起，用以增加肠上皮细胞表面积，以利于营养的快速吸收。

应力纤维（stress fiber）:广泛存在于真核细胞。
成分：肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和?-辅肌动蛋白。介导细胞间或细胞与基质表面的粘着。
（细胞贴壁与粘着斑的形成相关，在形成粘合斑的质膜下，微丝紧密平行排列成束，形成应力纤维,具有收缩功能。）

收缩环由大量反向平行排列的微丝组成，其收缩机制是肌动蛋白和肌球蛋白相对滑动。
肌肉收缩(muscle contraction)
肌肉可看作一种特别富含细胞骨架的效力非常高的能量转换器，它直接将化学能转变为机械能。
◆肌肉的细微结构(以骨骼肌为例)
◆肌小节的组成
◆肌肉收缩系统中的有关蛋白
◆肌肉收缩的滑动模型
◆由神经冲动诱发的肌肉收缩基本过程
肌肉收缩系统中的有关蛋白
①肌球蛋白(myosin)—所有actin-dependent motor proteins都属于
该家族，其头部具ATP酶活力,沿微丝从负极到正极进行运动。
?Myosin Ⅱ
主要分布于肌细胞，有两个球形头部结构域(具有ATPase活性)和尾部
链,多个Myosin尾部相互缠绕，形成myosin filament,即粗肌丝。
②原肌球蛋白(tropomyosin, Tm)由两条平行的多肽链形成α-螺旋构型,位于肌动蛋白螺旋沟内,结合于细丝, 调节肌动蛋白与肌球蛋白头部的结合。
③肌钙蛋白 (Troponin, Tn)为复合物，包括三个亚基：TnC(Ca2+敏感性蛋白)
能特异与Ca2+结合; TnT(与原肌球蛋白结合); TnI(抑制肌球蛋白ATPase活性)
由神经冲动诱发的肌肉收缩基本过程
?动作电位的产生
?Ca2+的释放
?原肌球蛋白位移
?肌动蛋白丝与肌球蛋白丝的相对滑动
?Ca2+的回收
二．微 管（Microtubules）
●微管结构与组成
●装配
●微管特异性药物
●微管组织中心(MTOC)
●微管结合蛋白(MAP)
●微管功能
微管结构与组成
微管可装配成单管,二联管(纤毛和
鞭毛中),三联管(中心粒和基体中)。
装 配
◆装配方式

◆所有的微管都有确定的极性

◆微管装配是一个动态不稳定过程

α-微管蛋白和β-微管蛋白形成αβ二聚
体,αβ二聚体先形成环状核心(ring),经过侧面
增加二聚体而扩展为螺旋带,αβ二聚体平行于
长轴重复排列形成原纤维(protofilament)。当螺
旋带加宽至13根原纤维时,即合拢形成一段微管。

?微管装配的动力学不稳定性是指微管装配
生长与快速去装配的一个交替变换的现象

?动力学不稳定性产生的原因：
微管两端具GTP帽(取决于微管蛋白浓度),微
管将继续组装,反之,无GDP帽则解聚。
微管特异性药物
◆秋水仙素(colchicine) 阻断微管蛋
白组装成微管，可破坏纺锤体结构。
◆紫杉酚(taxol)能促进微管的装配,
并使已形成的微管稳定。
◆为行使正常的微管功能,微管动力学
不稳定性是其功能正常发挥的基础。

微管组织中心(MTOC)
◆概念：

◆常见微管组织中心

◆中心体(centrosome)

◆基体(basal body)


微管在生理状态或实验处理解聚
后重新装配的发生处称为微管组织中心(microtubule organizing center, MTOC)。
常见微管组织中心
◆间期细胞MTOC：? 中心体(动态微管)

◆分裂细胞MTOC：?有丝分裂纺锤体极(动态微管)

◆鞭毛纤毛细胞MTOC：?基体(永久性结构)

中心体(centrosome)
?中心体(centrosome)结构
?中心体复制周期
?γ管蛋白：位于中心体周围的基质中，环形
结构，结构稳定，为αβ微管蛋白二聚体提
供起始装配位点，所以又叫成核位点
基体(basal body)
?位于鞭毛和纤毛根部的类似结构称为基体（basal body ）

?中心粒和基体均具有自我复制性质

微管功能
◆维持细胞形态

◆细胞内物质的运输

◆细胞器的定位

◆鞭毛(flagella)运动和纤毛(cilia)运动

◆纺锤体与染色体运动
维持细胞形态

用秋水仙素处理细胞破坏微管,导致细胞
变圆,说明微管对维持细胞的不对称形状是重要
的。对于细胞突起部分,如纤毛、鞭毛、轴突的
形成和维持, 微管亦起关键作用。
细胞内物质的运输
真核细胞内部是高度区域化的体系, 细胞中合成的
物质、一些细胞器等必须经过细胞内运输过程。这种运
输过程与细胞骨架体系中的微管及其Motor protein有关。

?Motor proteins
?神经元轴突运输的类型及运输模式
?色素颗粒的运输
Motor proteins
目前已鉴定的Motor proteins多达数十种。根据其
结合的骨架纤维以及运动方向和携带的转运物不同而分
为不同类型。胞质中微管motor protein分为两大类：
驱动蛋白(kinesin):通常朝微管的正极方向运动
动力蛋白(cytoplasmic dynein)：朝微管的负极运动
Kinesin与Dynein的分子结构
Kinesin与Dynein的运输方式
鞭毛(flagella)运动和纤毛(cilia)运动
?纤毛和鞭毛的运动形式

?纤毛与鞭毛的结构

?纤毛运动机制
三、中间纤维（intermediate filament,IF)
10nm纤维,因其直径介于肌粗丝和细丝之间, 故被命名为中间纤维。IF几乎分布于所有动物细胞，往往形成一个网络结构，特别是在需要承受机械压力的细胞中含量相当丰富。如上皮细胞中。除了胞质中，在内核膜下的核纤层也属于IF。
●中间纤维的装配
●中间纤维的成分与分布
●中间纤维结合蛋白（ IFAP ）及其判定标准
●中间纤维的功能
中间纤维的装配
◆中间纤维装配过程
◆IF装配与MF,MT装配相比，有以下几个特点：
?IF装配的单体是纤维状蛋白(MF,MT的单体呈球形)；
?反向平行的四聚体导致IF不具有极性；
?IF在体外装配时不需要核苷酸或结合蛋白的辅助，
在体内装配后，细胞中几乎不存在IF单体(但IF的存在
形式也可以受到细胞调节，如核纤层的装配与解聚)。
中间纤维的成分与分布
IF成分比MF,MT复杂，具有组织特异性。
IF在形态上相似，而化学组成有明显的差别。

◆中间纤维类型与分布

◆中间纤维蛋白的表达具有严格的组织特异性

中间纤维的功能
◆增强细胞抗机械压力的能力
◆角蛋白纤维参与桥粒的形成和维持
◆结蛋白纤维是肌肉Z盘的重要结构组分，
对于维持肌肉细胞的收缩装置起重要作用
◆神经元纤维在神经细胞轴突运输中起作用
◆参与传递细胞内机械的或分子的信息
◆中间纤维与mRNA的运输有关

第二节 细胞核骨架

●核基质(Nuclear Matrix)

●染色体骨架

●核纤层(Nuclear Lamina)

核基质(Nuclear Matrix)
●形态结构

●成分

●核骨架结合序列

●功能
形态结构
◆研究核骨架的分级抽提方法
非离子去垢剂溶解膜结构系统,胞质中可溶性成分随之流失; 再用Tween40和脱氧胆酸钠处理,胞质中的微管、微丝与一些蛋白结构被溶去,胞质中只有中间纤维网能完好存留;然后用核酸酶与0.25mol/L硫酸铵处理,染色质中DNA、RNA和组蛋白被抽提, 最终核内呈现一个精细发达的核骨架网络, 结合非树脂包埋-去包埋剂电镜制样方法,可清晰地显示核骨架-核纤层-中间纤维结构体系。
成 分
核骨架不象胞质骨架那样由非常专一的蛋白成分组成,核骨架的成分比较复杂,主要成分是核骨架蛋白及核骨架结合蛋白,并含有少量RNA。
◆核骨架蛋白
◆骨架结合蛋白
◆其它

核骨架结合序列
◆ DNA序列中的核骨架结合序列(matrix associated region, MAR)
这部分DNA与核骨架蛋白的结合不为高盐溶液抽提所破坏,在基因表
达调控中有作用
◆核骨架结合序列的基本特征
◆ MAR的功能
?通过与核骨架蛋白的结合，将DNA放射环锚定在核骨架上；
?作为许多功能性基因调控蛋白的结合位点。

核骨架结合序列的基本特征
?富含AT
?富含DNA 解旋元件(DNA unwinding elements)
?富含反向重复序列(Inverted Repeats)
?含有转录因子结合位点。
功 能
◆核骨架与DNA复制
◆核骨架与基因表达
大量研究工作表明真核细胞中RNA的转录和加工均
与核骨架有关。具有转录活性的基因是结合在核骨架上
的; RNA聚合酶在核骨架上具有结合位点。
◆核骨架与病毒复制
◆核骨架与染色体构建

二、染色体骨架
●染色体骨架/放射环模型
●染色体骨架的真实性
◆银染法能选择性地显示染色体轴结构
◆DNA酶和RNA酶处理或用0.4mol/L H2SO4处理去除组蛋白,对染色体轴没有影响,用胰蛋白酶消化则染色体轴破坏,说明染色体轴是非组蛋白性的。
◆染色体骨架/放射环模型在分子水平上得到两个直接证据
●染色体骨架与染色体高级结构
三、核纤层(Nuclear Lamina)
●核纤层分布与形态结构
●成分——核纤层蛋白(Lamin)
●核纤层蛋白的分子结构及其与中间纤维蛋白的关系
●核纤层蛋白在细胞分化中的表达
●核纤层在细胞周期中的变化
●功能
成分——核纤层蛋白(Lamin)

◆哺乳动物和鸟类细胞中有
核纤层蛋白A
核纤层蛋白B
核纤层蛋白C

核纤层蛋白的分子结构及
其与中间纤维蛋白的关系
◆核纤层与中间纤维之间的共同点
?两者均形成10nm纤维;
?两者均能抵抗高盐和非离子去垢剂的抽提;
?某些抗中间纤维蛋白的抗体能与核纤层发生交叉反应
?LaminA和LaminC的cDNA克隆推导出核纤层蛋白的氨基酸顺序与中间纤维蛋白高度保守的α-螺旋区有很强的同源性, 说明核纤层蛋白是中间纤维蛋白.

核纤层在细胞周期中的变化
◆A型核纤层蛋白在组装核纤层时通过蛋白水解失去C端(异戊二烯化 ,isoprenylation)。核膜崩解, 核纤层解聚时, A型核纤层蛋白以可溶性单体形式弥散到胞质中。
◆B型核纤层蛋白则永久法x基化(farnesylated)，与核膜小泡保持结合状态,当核膜重现时,在染色体周围重装配, 形成子细胞的核纤层。

功 能
◆为核膜及染色质提供了结构支架