原核表达重组蛋白,自己获得的目的基因序列与NCBI上比对,有一处碱基不同,
氨基酸序列也是一处不同,在网站上UNIOROT上查到目的蛋白134处氨基酸V---A,而我现在获得的正是这样情况的。我最近在做原核表达,SDS-PAGE时候没有明显目的蛋白条带。是不是这一个氨基酸差异导致没有蛋白表达呢?而且SDS-PAGE考染后,胶上出现整齐的两条带,颜色很重,横贯整个胶面,就是在胶偏下部的位置。请各位高手帮忙啊,要 不毕业不了了~~呜呜
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回答者:网友
首先,你做个全菌体电泳,看看在目的marker处是否有自己的蛋白高表达出来,这样才做下一步。如果这个都没有,再好好鉴定一下,自己克隆的目的基因是否导入表达载体,转化是否成功。这个你也只需要用全菌体作为样本,用目的基因设计引物做个PCR就好了。如果扩增帝看袁具垂早万须别酸不出来,说明目的基因没有导入。如果扩增出来,适当改变诱导或者培养来自的条件和培养基的基360问答质。比如添加一些蛋白保报限些查住效护剂,或者低温诱导。这样防止意湖保你的蛋白是易降解蛋白,表达出来后不会被很快降解。
其实影响蛋白表达的因素太多太多,能写成一本析方回双书,关键你是要自己多查阅文献吸收了。如果你混毕业了,你盾协油染高乱曾绝来帝黄读研时候做的事情也不能内化为你的本领,将来,也帮助不大。