蛋白纯化，10mM的巯基乙醇怎么加入？？
我用PET-28a构建表达载体，转化入BL21表达蛋白,优化了IPTG诱导的的时间、浓度、及表达温度，这样优化条件以后，SDS发现目的蛋白表达的还差不多,于是进行下一步的超声破碎、过柱纯化。在过柱以前，SDS显示上清和沉淀中差不多，因为之前做的都是上清表达较多的蛋白，所以还按照纯化上清蛋白的步骤来，可是在纯化蛋白时，发现蛋白和柱子结合不牢，10MM和20mM的咪唑浓度就能将目的蛋白洗脱下来，有人建议加入10mM的巯基乙醇，第一次做这样的蛋白纯化，好多都不会，也没有师兄师姐可以咨询。我叙述下问题1、纯化蛋白中，具体在哪一步加入10mM的巯基乙醇呢，是在超声波破菌前还是在蛋白样品上柱子前加入呢？2、10mM的巯基乙醇该加入多少呢？谢谢各位！
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回答者：网友
1，一定是在超声之后，将样品高速离心收集上清液之后再加巯基乙醇。因为巯基乙醇挥发性很高，超声前加基本超声完就挥发光了。加入巯基乙醇后需要反应一段时间，确保二硫键被打开。 2，10mM的意思就是10mM/L，巯基乙醇原液应该是14.4M的，10mM就是稀释1440倍，假设你有100ml的样品要加 10mM 巯基乙醇，就是加69ul的巯基乙醇原液就可以了。 PS. HIS结合蛋白不牢原因很多，二硫键造成的聚体是其中的一种，可能还有蛋白本身结构的原因。 可以调整一下缓冲液中的盐浓度和pH值试试。
