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裂解方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解.化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法,通常会很少使DNA 断裂.这两种方法(包括SDS 和溶菌酶处理等)提取纯化DNA中常用的方法.机械裂解可以更均一的裂解细胞,同化学裂解相比,机械处里临图不夫林理具有更高的裂解来自效率和更低的选择性.机械处理可以更剧烈和全面的裂解细360问答胞,但也会造成DNA 的断裂.
一、机械裂解法主要有以下两中:
1.热休克(Thermal shock),既反复冻溶法,是一种常用的机械紧采讨了耐抗没土观报矿裂解方式比,通常由冷冻和解冻两部分组成(freezing and thawing),.原理:由于细胞内冰束落粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎.冷冻通常在液氮或-20°C冰上进行,解冻可以在37、50、65 或100℃水浴中进热休克比化学裂解温和,但是很有效,有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率.
2.超声波处理(Ultrasonication)既利用超声加热的方法,把细胞破碎.但这种处理会导式给巴报耐福立技果模致DNA 的断裂,所以加热不宜过剧烈,要设定好超声时间和间隙时间,一般超声时间不超过5秒,间隙时间最好大于超声时间,这些都有利于保护酶的活性.bead-beating 也是常用的机械处理方式,有报道指出bead-beating 比热休克和化学裂解的细胞裂解效果更好 虽然DNA产量较高,但通常得到的DNA片段较小是究扩航有致刻青.
二、 化学裂解和酶裂解法(在提核酸时联合使用)
主要是裂解液处理法,细胞裂解液的主要目的有以下几种:(1)利用去污剂破坏脂质双分子层,破裂细胞;(2)溶解蛋白;(3)蛋白变性使其稳定协;(4)抑制蛋白酶活性.
主要根据不同的目的,裂解液的组成有所不同,主要有提取核酸和蛋白两中.直质在提取RNA或DNA时正盾会,我们主要是要充分裂解细胞,得到更多的核酸;如果我们的目的乙图低分永太是蛋白,那要根据蛋白的位置、特性等因素考虑裂解液,在提取蛋白后,再根据实验需要复性蛋白阶每径克语侵应法列等.以下是细胞裂解中常用试剂和其作用:
50 mM Tr慢硫才配跳算铁式异民is-HCl pH 7.4(缓冲体系),150 mM NaCl(等渗体系),1 mM PMSF (强大的蛋白酶抑制剂),1 mM EDT德妈蒸尔重实微A(变性剂和稳定剂),5 μg/ml Aprotinin(蛋白酶抑制剂),5 μg见营太/ml Leupeptin(蛋白酶抑制剂),滑布岩1% Triton x-100(宽民血占离占斗又破坏细胞),1% Sodium deoxycholate(中度变性剂和蛋白溶解剂),0.1% SDS(强变性剂和蛋白溶解剂).7M 尿素,2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解),蛋白酶K等.