胚胎干细胞在体外是否分化

复制摘要： 人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)由囊胚期胚胎内细胞团分离培养获得，具有保持未分化状态的无限增殖能力。hESCs 具有多向分化潜能，在体内和体外均可分化形成所有三个胚层(外胚层、中胚层、内胚层)的衍生物。hESCs 一般在鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)饲养层上培养和扩增。为了优化培养条件，目前人们已发展了多种人类细胞饲养层和无饲养层、非条件培养基体系。hESCs 可以在体外定向诱导分化为多种细胞类型，为揭示人胚早期发育机制和发展多种疾病的细胞移植治疗奠定了基础。hESCs 可以在体外进行遗传修饰，将有助于揭示特定基因在发育过程中的调控和功能。对hESCs 的深入研究将极大地推动医学和生命科学的进展，并将最终应用于临床，造福人类。 关键词：人胚胎干细胞；定向分化；遗传修饰 胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)，尤其是hESCs 的建立、研究和应用在国际学术界引起巨大轰动，被认为是继“人类基因组计划”之后，医学、生命科学上的又一革命性进展。 hESCs 一般来自由体外受精卵发育成的囊胚期胚胎的内细胞团[1-2]。这些细胞具有正常的核型；表达高水平的端粒酶活性。端粒酶是一种可使细胞无限分裂的 RNA依赖性DNA聚合酶，负责维持染色体长度，为永生化细胞所特有，分化细胞内一般无此酶活性。 hESCs 的多能性在体内和体外都被得到证明。在体内，将hESCs 注射入免疫缺陷小鼠，形成含三个胚层衍生物的畸胎瘤[1]；在体外，将hESC 悬浮培养导致形成拟胚体(embryoid body, EB)。EB 中的细胞分别具有三个胚层特异的分子标志物。hESCs可在体外诱导分化为神经细胞、角质形成细胞、心肌细胞、内皮细胞、造血细胞、肝细胞、胰岛β 细胞、滋养层细胞等多种细胞类型。在研究人胚胎发育和疾病发生、器官和细胞移植治疗、基因治疗、药物筛选与新药开发方面，hESCs 具有广阔的应用前景。 1 hESCs 的来源、培养和扩增 囊胚期胚胎由内细胞团和滋养外胚层组成。前者将产生胚胎的所有组织和胚外结构，后者形成胎盘。hESCs 一般来自囊胚的内细胞团。首先用免疫外科方法去掉囊胚外围的滋养外胚层， 再将内细胞团平铺于经γ-射线或丝裂霉素C处理的MEF饲养层上，在高血清浓度条件下培养数天后，ESC 集落开始形成，此时须将ESC 集落转移至新鲜的MEF 饲养层[1-2]。此后为防止分化，须大约每隔7d 进行分散和重新平铺，分散的方法可以是微吸管机械分散，也可以用IV 型胶原酶消化分散。 在MEF饲养层上或在MEF条件培养基中培养的 hESCs 不可能应用于临床治疗，因其有可能将异种生物病原体由小鼠转移至人类组织。为解决这一问题，人们研究发现了多种可以维持hESCs 未分化状态扩增的人类饲养层细胞，包括人胎儿肌肉、人胎儿皮肤、成人输卵管上皮饲养层[3]、人类包皮饲养层[4]、人类子宫内膜饲养层[5]、成人骨髓基质细胞[6] 和分化的hESCs[7-8]等。 目前尚未发现与这些饲养层相关且能维持hESCs 自我更新的共同的活化因子。为避免异种生物污染，Ellerstrom等[9]发展了一种无异种生物培养基，建立了无异种生物人包皮成纤维细胞饲养层，并用酸性Tyrode’s 溶液溶解法代替常规的免疫外科方法分离内细胞团，由此得到的无异种生物hESC系SA611表达未分化状态标志分子，具正常双倍体核型及体内外多向分化潜能，已传三十多代并可冷冻保存。 传统的hESC培养方法需不断制备和鉴定MEF饲养层，不利于大规模培养hESCs。为此，Xu 等[10] 利用由细胞外基质，如Matrigel 或laminin(层黏素)组成的无饲养层体系培养hESCs 并取得成功，但这种方法仍然需要MEF 条件培养基。Xu 等[11]发现在非条件培养基中，碱性成纤维细胞生长因子bFGF 和BMP 信号拮抗因子noggin 协同作用可以维持 hESCs 未分化增殖，同时可以维持hESCs 的正常核型和体内外发育潜能。这一发现对于揭示hESCs 自我更新的分子机制2 hESCs 的体外定向分化 2 . 1 神经细胞 在含有胰岛素、转铁蛋白、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、肝素和FGF-2 的DMEM/ F12 培养基中培养EB, 其中心部位形成玫瑰花结，与早期神经管十分相似，并表达神经标志抗原 nestin 和Musashi-1。用dispase 进行酶处理，结合基于不同黏附力的分离方法，可以将中心部位的神经管样玫瑰花结从周围的扁平细胞分离出来。撤除 FGF-2, 平铺于鸟氨酸和层黏连蛋白底物上，这些 hESCs 来源的神经祖细胞可以体外分化成CNS所有三种主要细胞类型，即神经元、星形细胞和少突神经胶质细胞。大部分神经元呈谷氨酸能表型，少部分被γ-氨基丁酸(GABA)抗体标记，还有少量神经元表达一种多巴胺合成的限速酶——酪氨酸羟化酶 (tyrosine hydrolase, TH)。移植入新生鼠侧脑室后，这些神经祖细胞被整合进不同的脑区，包括大脑皮层、海马、嗅球、间隔、丘脑、下丘脑、纹状体、中脑、胼胝体、内囊和海马纤维束等。在这些区域， 神经祖细胞分化成神经元和星形细胞，且没有发现畸胎瘤的形成[12]。 Reubinoff 等[13]用含重组人EGF 和bFGF 的培养基培养hESC 集落，这些细胞集落发育成圆球体，球体中99%的细胞表达NCAM，97%的细胞表达中间纤维蛋白nestin。球体中的神经祖细胞在体外可分化为星形细胞、少突神经胶质细胞和成熟神经元。移植入新生鼠脑室后，大量细胞整合入宿主脑实质，并分化成三种神经系。移植的细胞可沿已经建立的迁移路线迁移，并以区域特异性方式分化，表明它们可对位置信息发生反应，并参与宿主脑的发育进程。 除神经祖细胞外，hESCs 还可被诱导分化为特定的神经元亚型。其中多巴胺神经元由于可用于帕金森氏病的移植治疗而引起人们的广泛关注。将 hESCs平铺于基质细胞MS5或MS5-Wnt(转染Wnt基因的MS5 细胞)饲养层上，可形成玫瑰花结神经上皮结构，表达神经标志分子Pax6、nestin、NCAM 和Sox1。机械分离玫瑰花结集落，重铺于多聚鸟氨酸/ 层黏连蛋白包被的盘中，在含SHH (sonic hedgehog)和FGF8 的N2 培养基中培养，接着在含 SHH、FGF8 并补充胶质细胞系来源的神经营养因子、二丁酰cAMP 和转化生长因子β3 的N2 培养基中生长，第二次传代的细胞分化后，30% — 50% 的细胞为Tuj1 阳性神经元，其中64% — 79% 的细胞表达酪氨酸羟化酶。 免疫细胞化学检测显示细胞在分化过程中依次表达中脑多巴胺神经元标志分子 Pax2、Pax5 和engrailed-1。电镜分析显示10% — 20%的细胞形成不成熟突触接触，2% —4% 的细胞形成成熟突触。反向HPLC 显示基础的和KCl 诱导的多巴胺释放。在65%的细胞中可检测到去极化诱导的动作电位，且该动作电位可被河豚毒素阻断。这些数据表明可在体外自hESCs 获得功能性中脑多巴胺神经元[14]。 Yan 等[15]通过在不同阶段使用FGF8 和SHH 处理神经上皮细胞分别获得前脑和中脑多巴胺神经元。使用FGF8 和SHH 是基于在多巴胺神经元发育过程中需要峡组织者(isthmic organizer)合成的这两种分子的作用[16-17]。此外，用一种简单的无血清悬浮培养体系也可以使hESCs 分化成多巴胺神经元[18]。将这种分化的细胞移植入6-羟基多巴胺损伤的鼠脑中(鼠帕金森氏病模型)，8 周后可在纹状体检测到存活的hESCs 来源的TH 阳性神经元。 hESCs 还可以体外诱导分化成运动神经元。用化学限定的贴壁集落培养体系使hESCs 分化成神经外胚层，再用视黄酸(retinoic acid, RA)和FGF2 处理，在含RA和SHH 的培养基上分化，最后在培养基中加入BDNF(brain-derived neurotrophic factor)、 GDNF(glial-derived neurotrophic factor)和IGF-1(insulinlike growth factor-1), 并降低SHH 的浓度。这种体外生成的运动神经元具电生理活性，与邻近神经元形成有功能的突触，可诱导乙酰胆碱受体的群集，并可建立有功能的神经肌肉传递[19]。Lim等[20]研究了三株hESC 系经EB 培养分化为运动神经元的方法，发现RA和SHH联合处理EB可使分化效率提高三倍以上，分化的运动神经元均表达特异标志分子 HB9。而Wnt3A和骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)对RA和SHH的诱导分化作用具有明显的抑制效应。自hESCs 生成的功能性运动神经元可以用于运动神经元相关疾病，如肌萎缩性侧索硬化症的药物筛选，也可以用于运动神经元疾病或脊髓损伤的细胞替代治疗。 2.2 星形细胞 中枢神经系统主要由神经元、小神经胶质细胞和大神经胶质细胞组成。星形细胞是大神经胶质细胞的主要类型，在中枢神经系统发育过程中有着广泛的支持功能。cyclopamine 是hedgehog (Hh)信号通路的抑制子，用cyclopamine 处理hESCs，随后在人星形细胞介质中培养，可导致hESCs 向星形细胞分化。分化的细胞表达星形细胞特异的标志分子胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，同时也表达神经标志分子nestin。神经营养因子，如胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)和脑源性神经营养因子(BDNF) 的表达水平也明显高于未经处理的对照细胞[21]。 2.3 黑素细胞 表皮黑素细胞保护皮肤免受紫外线伤害，其缺损可导致白化病、花斑和白斑等。Fang 等[22]利用Wnt3A、endothelin-3 和干细胞因子等生长因子在4 — 6 周内使hESC分化成黑素细胞群落。这些细胞表达黑素细胞标志分子，如小眼相关的转录因子和酪氨酸酶，发育出黑素体并产生黑色素。当整合进人重建皮肤时，它们象表皮来源的黑素细胞一样，聚集在沿基底膜的适当位置，移植入免疫缺陷鼠后仍保持稳定的表型。 2.4 角膜上皮细胞 角膜位于眼睛前部，由一复层上皮所覆盖。角膜上皮由位于缘区的干细胞不断更新。角膜干细胞则在缘微环境(壁龛)提供的各种因素中维持。由于该壁龛对于角膜干细胞十分特异，可以假设体外复制这些因素将导致hESCs 向角膜上皮样细胞分化。事实上， Ahmad 等[23]在Ⅳ型胶原包被的盘和缘成纤维细胞条件培养基中培养hESCs, 导致其多潜能性丧失并向上皮样细胞分化。扫描电镜观察发现hESCs 分化的细胞和缘上皮细胞一样具有很多微纤毛，但比缘上皮细胞要小得多。在hESCs 分化的过程中，Oct-4 和Nanog 的表达明显下降， SSEA4 的表达也急剧下调；而p63、CK3 等上皮特异基因的表达则相继上调。集落形成效率分析表明，从开始培养到第7d，集落形成效率逐渐上升，之后开始迅速下降，与p63 的表达变化相一致。 2.5 角质形成细胞 H9 细胞注射至SCID鼠2 个月后形成含角质形成细胞的团块，团块经胰酶消化并接种入含经辐射的3T3 细胞和FAD 培养基的平皿中，形成的集落具角质形成细胞的形态学特征并表达p63、碱性核蛋白和K14。继续培养20d 后发生7分层和终末分化并表达K14和外皮蛋白。由hESCs 形成的EB中也含有向角质形成细胞系分化的细胞，这些细胞自EB 周边向外迁移。迁移的细胞首先失去Oct-4 表达，接着依次表达p63、K14 和碱性核蛋白。最后，与3T3 细胞共培养导致终末分化及其标志物外皮蛋白的表达[24]。 Ji等[25]也自EB培养获得表达K14 的角质形成细胞，这些细胞在含氢化可的松的培养基中可以传代，加入钙离子后可诱导分层和终末分化。角质形成细胞的制备将在伤口愈合治疗中发挥重要作用。 2.6 心肌细胞 用hESCs悬浮培养方法形成EB，平铺于明胶包被的盘中，4 — 22d 后约8.1% 的EB 中出现按节奏收缩的区域。这些自发收缩的细胞可用机械方法进行分离，分离的心肌样细胞大多是单核的，呈圆形或杆状，含不同程度的肌纤维组织。在某些细胞中可观察到Z带，在许多分化的EB中还可观察到由缝隙连接和桥粒组成的闰盘。用免疫细胞化学方法可检测到α / β 肌球蛋白重链、α 肌动蛋白、心脏I 型肌钙蛋白(cTnI)、结蛋白(desmin)和 ANP，但伴肌动蛋白(nebulin)染色呈阴性，说明所检测细胞具心肌特性而非骨骼肌[26]。另一篇报道用相似的EB 培养方法获得心肌样细胞，其产生心肌样细胞的EB比例高达70%。此外还发现用5- 杂氮- 2- 脱氧胞苷处理可以加强心肌细胞分化，而DMSO 或视黄酸则无此作用[27]。Norstrom等[28]用EB 培养方法获得心肌样细胞，自发跳动的细胞群落占EB总数的30%。这些细胞群落可以分散成单个细胞悬液并可冷冻保存。用电镜可观察到Z 盘和紧密连接；用免疫组化分析可检测到心脏特异分子的表达。药物学刺激可导致肾上腺素能和毒蕈碱能受体偶联系统的反应。Yoon 等[29]则发现悬滴培养结合5- 杂氮胞苷处理可大幅度提高hESCs 向心肌细胞分化的效率。这一发现也说明基因的甲基化状态在心肌发育过程中扮演重要的角色。Pal 和Khanna[30]自两株不同来源的hESC系用相同的方法获得EB, 接着用含低浓度胎牛血清的培养基培养，并加入BMP-2, 由此获得的心肌细胞表达心脏基因和蛋白，并对功能分析发生反应。在培养的EB 中加入noggin 可拮抗 BMP-2 的诱导作用和简化hESCs 培养都具有重要意义。目前，无饲养层、非条件培养基体系已成为很多实验室的常规方法。