悬浮培养方法：在悬浮培养前,对动物细胞的生长和生理特性进行充分的考察,是十分必要的,能为悬浮培养提供有益的向些娘吧参考.悬浮培养可以从两个方面入手,一是改变动物细胞的培养环境,实碰怕食氧主甲留陈流固东感漏行阶段培养；二是进行代谢调控. （1）阶段培养 ：一般认为,动物细胞的培养条件应尽量模拟来源动物体内的条件,而且在培养中通常保持不变.而实际上,每种细胞的最适生长条件和最适产物生成条件是不同的.阶段法培养就是根据这一点,把培养过程分为细胞生长期和产物生成期,分别采取不同的培养条件,以达到在细胞生长期使接种细胞大量繁殖,提高比生长速率,尽快获得高密度细胞；在产物生成期保持细的高密度,维持存活率,降低细胞死亡速率,持续获得高产率蛋溶细下倍话经这白的目的.当产物蛋白对细胞有抑制时,阶段培养尤见优势燃倍宜慢得.具体说来,可以用以下方法： ①pH值阶段培养 对大多数动物细胞,培养液中合适的pH为7.2-7.4.低简酒验环线析胜于6.8或高于7.6对细胞的生长都不利.近年来,对胞内pH的研究比较活跃.实验发现是回述头马管跑限胞内pH对细胞的代谢影响很大,胞内pH 降低0.2个单位,就足以使若哪磷酸果糖激酶失活,抑制糖酵解途径,使细胞的生长受阻；而胞歼迹内pH 升高0.2个单位,可以提高糖酵解速度50%.胞外pH 的降低和培养液中铵离子浓度的提高,都能引起胞浆酸化,胞内pH降低.有人把CO2的浓度由5%降为2.5%,胞内pH提高了0. 2个单位.胞内pH比胞外pH的检测麻烦,所以还没有广泛应用. ②溶氧阶段培养 不同细胞陈和同一细胞在不同生长时期艺财团来对氧的需求均不相同.有人发现细胞生长的最适溶氧值为6必原学0%,但有人发现杂交瘤的最的响态适溶氧为100%.一般说来,溶氧主要影响细演滑坏毫胞的繁殖,而对产物的生成无直接影响,通过影响细胞生长间接起作用.通常在细胞生长初期控制溶氧的较低的水平,在对数生长期,当细哪构秋注胞达到较高的浓度时,提高溶氧水平；在产物生成期,应控制溶氧的适当水平.溶氧过高,细胞就会加速消耗营养物质,产生许多代谢产物.这些代谢产物对细笑改烂胞有抑制作用,会大大降低细胞的存活率,降低产物的比生成速率.溶氧过低,细胞过氧的需求得不到满足,依然会降低产物蛋白的产决滑马令想负物. ③化学试剂诱导阶段培养 如果构建的细胞上有可诱导基因,进入产物生成期后,就可以添加化学试剂对基因进行诱导,以实现目的基因的高表达,比如,将表达尿激照应厚台卷措酶原和二氢叶酸还原酶基因的两个转录单位置于同一载体,分别受金属硫（MT）轮士广双督功娘形哥克议和SV40早期启动子控制,具有用氨甲喋呤（MTX）使基因扩增和利用金属Zn2+诱导的双重功能,有利于尿激酶的高介居来表达.细胞在细胞周期的不同时期,不仅蛋白的分泌速率不同,而且所分泌蛋白的类型和糖基化程度也可能不同.因英错战游感服东责怕素差此,研究并控制细胞的生理状态很重要.然而,在细胞培养中,细胞生理状态的检测很麻烦.有人发现,细胞大小随各时期变化很明显,因此可以作电子细胞计数器就行了.分段培养应结合具体的培养条件进行.有些细胞的最适生长温度和产物生成温度相同,就不能进行温度阶段培养,而应寻找别的差异条件.在细胞生长期有的细胞可能会因比生长速率过大而产生非生产性细胞,这时就应控制比生长速率在一个适当的范围.（2）代谢调控培养 乳酸和氨是在培养过程中动物细胞产生的主要代谢产物,对细胞的正常生理功能在抑制甚至毒害作用.在分批培养和补料分批培养中的这一问题尤为突出.尽管灌注培养可以通过提高灌注速度来去除抑制产物.但是,一方面由于灌注培养细胞浓度很高,提高灌注速率,营养成分的供给十分充分,氨和乳酸的产生速率也增加了.另一方面,过高的灌注速率提高了细胞的比生长速率,降低产物的比产率,加上细胞对营养的利用并不彻底,培养液中会残留大量的蛋白,造成提取纯化的不便和培养基的浪费.所以,在培养中调控动物细胞的代谢途径一直较受重视.通过代谢调控,可以减少副产物的产生,降低细胞的死亡速率,还可以控制灌注速率和培养液成分,控制细胞的状态和比生长速率,以提高目标蛋白的产率.具体有以下方法： ①控制葡萄糖浓度法 乳酸浓度升高,会导致比生长速率降低,比死亡速率升高.乳酸的降低可更换葡萄糖为己糖如果糖或半乳糖,还可限制葡萄糖减少乳酸的生成,使初始葡萄糖浓度较低,在培养过程中再添加.在控制葡萄糖浓度法培养中,生长期可以使葡萄糖浓度稍高,以促进细胞生长；在产物合成期降低葡萄糖的浓度,降低乳酸的产生速率,避免乳酸的积累,减少毒害,降低死亡速率,维护持活细胞数在较高水平.同时还可以降低比生长速率,增加目标蛋白的产生速率.灌注葡萄糖的同时,要间歇或连续地加入其他组分,以避免营养缺乏,其中谷氨酰胺要保持在较低水平,因为细胞的生长不依赖糖酵解,即使没有葡萄糖,细胞仍可以通过降解谷氨酰胺获得能量.假如谷氨酰胺的浓度过高,细胞就会偏向谷氨酰胺酵解,从而削弱这种方法的效果.由于葡萄糖的价格相对低廉,这种方法很有前途. ②控制谷氨酰胺法 上面提到,没有葡萄糖,细胞可以利用谷氨酰胺作能量物质.因此,控制谷氨酰胺比控制葡萄糖要容易些,应用这一方法的报道也较多.控制谷氨酰胺浓度的目的,主要是减少氨的产生.氨对细胞的毒性比乳酸大得多,表现为降低比生长速率,增加死亡速率.有人详细地研究了动物细胞的代谢过程,采用底物限制补料分批工艺对动物细胞进行代谢控制.他采用这一方法,使氨的浓度降低了一半.控制谷氨酰胺法与控制葡萄糖法一样,要维持葡萄糖在较低水平. ③控制葡萄糖和谷氨酰胺法 在细胞中,葡萄糖代谢和谷氨酰胺代谢密切相关.葡萄糖消耗上升,则谷氨酰胺消耗下降,反之亦然.在相当大的一个范围内,葡萄糖和谷氨酰胺的消耗速率与其浓度成正比.控制葡萄糖和谷氨酰胺法可降低乳酸和氨的产生,还能有效控制比生长速率.在细胞生长期,提供充分的营养,供细胞的需要；在产物合成期,降低葡萄糖和谷氨酰胺的浓度或流量,降低比生长速率,增加目标蛋白的产率. ④去除代谢产物法 通常使用透析膜,超滤腊或吸附剂选择性去除乳酸、氨或铵离子.有人建议加化学试剂比如钾盐来消除氨的影响 ,也有人建议可使用有谷氨酰胺合成酶的细胞. 3、灌注培养的缺点 灌注培养发展到现在,还有许多急待解决的问题.其最大的缺点是培养基的利用不充分,造成一定的浪费.随着细胞培养技术和产品分离技术的进一步发展,建立细胞培养与产物分离的耦合系统,能充分利用培养液,降低生产成本,一直是人们追求的目标,这里就不赘述.
