微生物分离实验

： 从复杂的 群体中获得只含有一种或某一株 的过程称为 的分离与纯化。常用的方法有 1、简单 挑取法 2、平板分离法 此次实验采取的是平板分离法，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化。其原理包括两方面： 1、在适合于待分离微生物的生长条件（如营养、 、温度与氧等）下培养微生物，或加入某种 造成只利于待分离微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 2、微生物在 上生长形成的单个 可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取 而获得 。获得 的方法可通过稀释 平板或平板划线等方法完成。 但是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个 并不一定保证是 。因此， 的确定除观察其 的特征外，还要结合 检测个体形态特征后才能确定。有的微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 土壤是微生物生活的 ，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微 的重要场所，是发掘 的重要基地，可以从中分离纯化的到许多有价值的 。此实验将从土壤中分离两种细菌。 实验器材、试剂与 ： 1、器材： 、 、 、 、 、 、 、 、三角瓶、 、 、 、 、 杯、 、高温 、 （枪头）、 、 、 等。 2、 试剂： 配制 的原料（ 、NaCl、 、 ）、配置糖 的原料（ 、K2HPO3、 、 、NaCl、 ）、 （ ）、 染液、番红染液、碘液、95％乙醇、5％ 染液、0.5％番红水染液、3％ 水溶液、1％盐酸二甲基对苯撑二胺溶液、 等。 3、 土样：取自 7号宿舍楼门前土壤，地下10cm左右。 实验步骤： 1、配制 蛋白胨 ： 1）配制 500ml （用于12个平皿和10支试管斜面） 牛肉膏 0.3% ………………………………… 1.5 g 蛋白胨 1% …………………………………… 5g NaCl 0.5% ………………………………… 2.5g 2% …………………………………… 10g pH ………………………………………… 7.0~7.2 2）倒12个平板和10支试管斜面，包扎，121℃灭菌20min. 2、制备土壤 ： 称取土样10g，放入盛有100ml 的带有 的三角瓶中，振荡摇匀10min 使土和水充分混合，然后用 从三角瓶中吸取1ml（此操作要求 ），加入另一盛有9ml 的试管中，混合均匀，以此类推分别制成制成0.01、0.001、0.0001不同 的土壤溶液。 3、 培养： 以0.01以及0.0001两个浓度的土壤 作为 的对象，将其分别涂布在3个牛肉膏蛋白胨 中，共6个培养基，标号，37°C温箱培养48 h。 4、划线分离（划线培养）： 对两种土壤溶液的 基进行观察，记录两种区分明显的细菌性状。挑取此两种细菌在新的培养基中划线培养（每种 3个 ），标号、37°C培养。 5、初步鉴定： 对两种菌进行简单染色、 以及 观察，记录结果。 6、试管斜面再培养： 将两种纯 接种分别接种在5支试管中，共10支试管。37°C培养（18－24h）。 7、对试管中培养的两种菌进行生理生化鉴定： 1） 鉴定： A ： 与许多 与其他细菌区分的主要依据是鉴定有无 。该酶可以把 分解为水与氧气，气体氧以气泡跑出来，则为 实验阳性。 和许多 在 酶实验中呈现阴性。 B 步骤： 将培养新鲜的待测 （培养18－24h内）接在 上，滴一滴3％过 于菌体上。 2）糖发酵与氧化实验 A ： 在细菌的分类鉴定中，糖发酵与氧化测定是一项重要的依据。绝大多数细菌都可以利用糖类作为能源以及碳源，但由于不同的菌存在酶系的差异，因而对糖类的发酵与氧化的能力就有所不同。有的在糖类发酵与氧化代谢中能分解糖类，产酸产气，有的则只能产酸不可以产气。酸的产生与否，以及是发酵型产酸还是氧化型产酸，可以由预先加在培养基中的 （ 水溶液）呈现出来。这样把接好 的培养基放在 或好氧的环境下培养，培养基有绿色变为黄色为产酸，是否产气是通过观察培养基中是否产生气泡或培养基断裂来测定。 B 步骤 ① 配置糖 150 ml （ ：、K2HPO3：、 、琼脂：、NaCl：、蛋白胨：），分装试管。 ② 110°C灭菌培养基20 mins （同时灭菌一定量 ，待用）。 ③ 对两种细菌进行“穿刺”培养，每种菌做5个试管：2个盖管培养，2个开管培养，一个为盖管 。在培养基的上方加入1－2cm厚的 ，作为“盖 管”，以提供菌体无氧的生长环境，开管则不加甘油，作为有氧的生长环境供菌体生长。 ④ 在37°C下培养，并在培养24h后观察培养基中颜色的变化，以及有无气泡。 3） 测定 A 实验原理 是 的一种，它在有分子氧以及 存在时，可以氧化二甲基对苯撑二胺，使之呈现 或暗红色，在此基础上还可以与a－ 结合生成 酚兰，出现蓝色 B 步骤 在干净 中放一 ，用火柴棒取培养18－24h的鉴定菌苔黏在 上，滴一滴1％盐酸二甲基对苯撑二胺溶液于菌苔上，进行观察。