器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，台式离心机，干式恒温气没批压前济钢策跑浴。
试剂
T 载体，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液帮道明，无菌dd Water
操作步骤
PCR产物与T载体直接连至划定列接：
（1） 事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度掉振出设定在14~16°步移湖察C。
（2） 取4个灭菌的入传席甲伯以动200ul微量离心管，加入：（需要调整）
4ul 目的基因
1ul T载体
0电为预轻海屋清定质们收.5ul T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul）
1ul 连接酶缓冲液10 x buffer
3.5 ul dd Water
总量10ul 体系
（3） 上死述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14°C干式恒温仪（或14°C水中）中保温过夜（12-16h）。
（4） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用。
大肠杆须破菌感受态细胞的制备细放答征鸡菌转化
器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，顺宜苦证50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，穿超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱，滤膜和过滤器
试剂
E. coli菌种，LB培养基，0.1 mol/L CaCl2溶液，无菌dd Water ，LB培养基（不加抗菌素），L采想结度无的镇兴声沙B培养基（加抗菌素），无菌dd water，IPTG，X-gal。
步骤
（1） 在超净成歌工作台中，将1ml大肠杆菌菌液加入100m历著l LB液态培养基（不含抗菌素），37℃摇床培养过夜。
（2） 取0.5ml上述菌液转接到含有50mL LB培养基的三角烧瓶中，37℃下250r/价掌川每间远氧律械北min摇床培养2~3h，测定OD590为0.35~0.4左右（<0.4~0.6，细胞数<108/而家广钢德万mL，此为关键参数！）。灯历鸡查损（注意：此步摇菌的时候，要有一管不加菌的LB培养液同时摇菌）
（3） 将1ml菌液加入到4支1.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4℃，5000rpm离心5min。
（4） 将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。
（5） 4℃，5000rpm离心5min，弃上清液后，用100μL 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，插入冰中放置2h，可以直接用作转化实验，或立即放入-4摄氏度冰柜中保藏。
（6） 事先将恒温水浴的温度调到42℃。
（7） 从-70℃ 超低温冰柜中取出一管（100μL）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。
（8） 加入5μL连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。
（9） 轻轻摇匀后插入42℃水浴中90s进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3min。
（10） 在超净工作台中向上述各管中分别加入300μL LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h。
（11） 在超净工作台中取上述转化混合液200μL，分别滴到含合适抗菌素（Amp 100mg/L）的固体LB平板培养皿中，再在平板上滴加40μL 20mg/ml X-gal，7μL 200mg/ml IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：一个不含抗生素作为对照组，玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂，菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。）。
（12） 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。
（13） 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面。
（14） 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。 器材
旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌牙签，摇菌管。
试剂
LB培养基（加抗菌素），PCR用试剂，引物，质粒提取用试剂，酶切需要的限制性内且酶及其缓冲液，65%甘油（65%甘油，0.1mol/L MgSO4，0.025mol/L Tris Cl pH8.0）。
操作步骤
方法一：快速PCR筛选法
（1） 在转化的平板培养基上随机选取4个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。
（2）在0.2ml PCR 微量离心管中配制25μl反应体系。
dd water 16μl
10×PCR buffer（不含MgCl2）2.5μl
25mM MgCl2 1.5μl
2.5mmol/L dNTP 2μl（每种dNTP终浓度0.2mM）
10μmol/L Primer1 1μl（12.5—25pmoles）
10μmol/L primer2 1μl（12.5—25pmoles）
模板质粒 用小tip头轻轻粘一下选中的白色菌落，再伸入PCR混合液中洗一洗
Taq酶 0.5μl（1.5u）
总体积 25μl
（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序（本实验室已经设置为WZ）：
① 94℃5min
②94℃1min
③60℃1min
④72℃1min50s
⑤goto②29 times
⑥72℃10min
（2） PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳（与原始插入片断同时比对）。观察胶上是否有预计的主要产物带。
（3） 按照编号找到培养皿中的原菌斑。根据需要进行放大培养提取其质粒
（4） 提取到的质粒与原先的空载体（或已知分子量的质粒）再对比电泳，以进一步确认。
方法二：提质粒再PCR或酶切鉴定
（1）在超净工作台中取3支无菌摇菌管，各加入3mL LB（含50mg/mL氨苄青霉素），用记号笔写好编号。
（2）在超净工作台中将70%乙醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过，镊取一支无菌牙签。用牙签的尖部接触转化的平板培养基 上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有3mL LB（含50mg/mL氨苄青霉素）的摇菌管中。用此法随机取3个白色菌落，分别装入3个摇菌管中。
（3）37℃摇菌过夜后，用碱裂解法分别提取质粒。摇菌管中的剩余菌液保留在4℃冰箱中。
（4）提取到的3管质粒样品可用PCR法扩增，或用酶切电泳法来鉴定其上是否含有外源插入片断（方法见有关实验）。
（5）将经过鉴定判断为正确的质粒保存。按照编号找到冰箱中原菌液。根据需要进行放大培养提取其质粒或进行诱导表达，或取500mL菌液与500mL 65%甘油混合后-80℃保存。
（6）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面
