试述Kunkel突变法的基本步骤?

①将待突变基因克隆到突变载体(M13噬菌体DNA)上。
②导入具有dUTP酶(dut)和尿嘧啶-N-糖基化酶(ung)双缺陷的大肠杆菌菌株中培养，制备含U的单链模板DNA。(模板DNA中大约1%的T被U取代)
③合成DNA的另一链：在DNA聚合酶的催化下，5'端磷酸化的突变寡核苷酸引物以单链DNA为模板合成互补链，而后由连接酶封闭缺口，产生闭环的双链DNA分子。
④将双链DNA分子转染野生型大肠杆菌，模板链被降解，突变链因不含U被保留下来。
⑤序列分析确定突变体。