rna探针制备时为什么将模板线性化

在RNA的杂交检测实验中，应用标记的RNA 探针将获得高灵敏度的杂交检测结果，与DNA 探针相比，检测灵敏度提高10-100倍。因为对于不同的杂交体类型来说，RNA-RNA杂交体的结合强度高于RNA-DNA和DNA-DNA杂交体。对于通过Northern blots检测低浓度mRNA，以及原位杂交的核酸定位检测等应用，RNA探针是一种理想选择。RNA探针同样也适用于Southern blots，文库筛选，斑点杂交等应用。但是，在RNA探针制备过程和整个杂交实验过程中，必须注意RNAse的防污染操作。

制备RNA探针的常用方法是构建含探针标记模板的重组质粒，将克隆子的转录区下游进行限制性酶切线性化后，进行体外转录的探针合成反应。当然，采用的质粒上必须含有SP6，T3或T7 RNA聚合酶的启动子序列。体外转录法合成的探针量很大，通常情况下，1μg的DNA模板进行反应，将得到20μg的标记RNA探针。

另一种更加直接的体外转录标记法，是先通过PCR方法制备DNA探针模板。扩增引物需要特殊设计，包含SP6，T3或T7 RNA聚合酶的启动子序列。

对于原位杂交的应用，为了更好地进行杂交反应的质控，建议在制备反义链探针的同时，也制备正义链的探针，用作杂交实验的阴性对照。在原位杂交实验前，首先通过Northern blots实验验证探针的有效性和目标转录子在不同样本中的表达模式，有助于简化后续原位杂交实验的优化流程和结果解释。