羟肟酸铁和异羟肟酸铁反应原理为:
酯与羟胺作用可生成异羟肟酸，再与三氯化铁作用即生成红色的异羟肟酸铁：
R-COO-R' + NHOH→R-CONHOH (异羟肟酸) + R'-OH,
R-CONHOH + FeCl3→（R-CONHO)Fe(异羟肟酸铁) + 3HCl
羧酸衍生物均能进行上述反应，这是识别这类化合物与其他类型化合物的一种常用的方法
