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1 Red 重组系统的组成
exo 基因的产物是λ核酸外切酶,它可将dsDNA 5′端切开,产生3′端突出[8 ] 。由结晶学研究发现,该核酸外切酶在溶液中是环形三聚体,具有一个到达中心的通道,一端可以调节dsDNA ,另一端调节ssDNA[9 ] 。bet 基因编码的β蛋白,可与ssDNA 结合促进互补链的复性,并可以介导DNA 链退火和交换反应[10 ] 。它在溶液中的游离状态为环状物,当结合到ssDNA时形成大的环状物,当结合到dsDNA 时形成螺旋状纤维。这些结构特点揭示了β蛋白属于重组蛋白家族中的一员,该家族包括S almonella 噬菌体P22 的Erf 蛋白, E. coli 隐蔽型原噬菌体Rac 的RecT 蛋白,真核生物的Rad52 蛋白[11 ] 。β蛋白与λ核酸外切酶形成复合物,调节核酸溶解(nucleolytic)和重组启动。gam 基因的产物是一个分子量为16000Da 的多肽, 结合到宿主的RecBCD 蛋白, 形成二聚体, 抑制RecBCD 的外切酶活性[12 ,13 ] 。另外E. coli 隐蔽型原嗜菌体Rac 的重组系统与Red 重组系统相似。前者的recE 与exo相似,编码一种核酸外切酶; recT 与bet 相似,编码一种结合于ssDNA 促使链交换的蛋白[14 ] 。二者的重组机理相同,可以说是同一类重组系统。
2 Red 重组的机制
有关λ噬菌体重组系统方面的研究已有数十年的历史,自上世纪60 年代始,就有人报导λ编码的产物可以促进细菌发生重组[15 ] ,Clark 和他的同事发现具有λRed 系统的菌
株在同源重组时不依赖细菌本身的重组系统。因而认为Red 重组是一个独立的重组系统。其重组的分子机制如下:同源重组涉及到参与重组的两条dsDNA 的断裂和复合。在Red 重组系统中,该系统表达的Gam 蛋白抑制了宿主RecBCD 的所有外切酶活性。然后通过自身表达的λ核酸外切酶和β蛋白完成两条发生同源重组的dsDNA 的断裂和复合,剩余重组步骤在宿主蛋白的作用下完成[16 ] 。当发生重组的两条dsDNA 都有断裂切口,且不在同一位点时,Red 重组系统将以退火的形式促进两条dsDNA 的断裂和复合[17 ] (图1 右) :λ核酸外切酶结合到两条dsDNA的切口末端,自5′末端向内切割DNA , 留下游离的3′末端[8 ] ,在β蛋白的介导下两条双链DNA 的单链区发生退火,缺口在连接酶作用下重新连接,形成新的DNA 分子。
当发生重组的两条dsDNA 中只有一条断裂,另一保持完整时,重组将以侵入的形式进行(图1 左) :λ核酸外切酶结合到断裂的dsDNA 的切口处,酶切形成游离3′单链DNA区段。在RecA、β蛋白和一些其他因子的共同作用下,3′单链DNA 区段侵入到另一dsDNA 分子的因局部解链而产生的单链泡中[18～20 ] 。形成三链结合(three stranded junction) , 再在RecQ 解螺旋酶的作用下发生分支迁移,形成异源双链(heteroduplex) ,进而在内切核酸酶作用下形成Holliday junction ,RuvC 把连锁在一起的两条DNA 分子分开,修复错配的碱基后形成同源双链(homoduplex) ,同源重组完成。因此该重组方式又被称为分支迁移———异源双链形成———错配修复途径( migeration2heroduplex formation2mismatch repair pathway) 。
