其他回答
详细见SN0169-92,里面对水的大肠菌群的检测方法有严格的规定。中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群 SN 0169—92 和大肠杆菌检验方法 代替 ZB X09 002一88 Method for examination of coliform, fecal coliform and escherichia coli in food for export ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 1 主题内容与适用范围 本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。 本标准适用于出口食品的检验。 2 设备和材料 2.1 吸管: 1mL,具0.1mL刻度；5mL和10mL,具1mL刻度。 2.2 水浴箱：44.5±0.5℃。 2.3 培养箱：36±1℃,44.5±0.5℃。 2.4 冰箱: 0～5℃和-15～-20℃。 2.5 均质器。 2.6 乳钵和研棒。 2.7 平皿：直径90mm。 2.8 天平：感量0.1g。 2.9 显微镜。 2.10 稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。 2.11 玻璃珠：直径约5mm。 2.12 菌落计数器。 3 培养基及试剂 3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤。 3.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。 3.3 EC 肉汤。 3.4 伊红美蓝琼脂(EMB)。 3.5 营养琼脂斜面。 3.6 色氨酸肉汤。 3.7 MR-VP培养基。 3.8 Korser氏枸椽酸盐肉汤。 3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。 3.10 Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液。 3.11 生理盐水。 3.12 革兰氏染色液。 3.13 Kovacs氏靛基质试剂。 3.14 甲基红指示剂。 3.15 Voges-pros kauer(V-P)试剂。 4 样品制备 4.1 以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。若不能 及时检验,应将冷冻样品置于-15℃保存；非冷冻而易腐的食品,应置于4℃冰箱保存。检 验前冷冻样品可于2～5℃ 18h内解冻,或在45℃以下15min内解冻。 4.2 不同食品样品匀液的制备 4.2.1 液体食品 以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠), 以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇),制成1:10的样品匀液。 4.2.2 固体和半固体食品 以无菌操作取25 g样品,放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000 r/min均质 1～2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。 4.3 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递 增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。从制备样品匀液至稀释完毕,全过程 不得超过15min。 5 大肠菌群的测定 5.1 大肠菌群MPN值的测定 5.1.1 对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月 桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。 5.1.2 将接种管置于36±1℃培养48±2h。 5.1.3 观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,记录在24h和48h内产气的LST 肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气,则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者,则进一 步作证实试验。 5.2 大肠菌群的证实试验 5.2.1 将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。 5.2.2 置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h。 5.2.3 记录所有BGLB肉汤管的产气管数。 5.2.4 结果报告：按BGLB肉汤产气管数,查MPN表[见附录B (补充件)]报告每克(毫升)样 品中大肠菌群的MPN值。 6 粪大肠菌群测定 6.1 用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。 6.2 将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养24±2h。水 浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不 产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。 6.3 记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群 试验阴性。 6.4 结果报告：按产气管数,查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的MPN值。 7 大肠杆菌测定 7.1 将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h,取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB) 平板,36±1℃培养24±2h。 7.2 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。 7.3 如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平 板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃ 培养18～24h。 7.4 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。 7.4.1 色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL,上层出现红 色为靛基质阳性反应。 7.4.2 MR-VP培养基：在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1 mL至13mm×100mm 试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试 管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。 将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基 红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。 7.4.3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长。 7.4.4 LST肉汤：于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气。 7.4.5 革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。 7.4.6 大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下： ━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━━━ 靛 基 质┃ MR ┃ VP ┃ 枸椽酸盐 ┃ 鉴定(型别) ━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━ ＋ ┃ ＋ ┃ － ┃ － ┃典型大肠杆菌 － ┃ ＋ ┃ － ┃ － ┃非典型大肠杆菌 ━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━ ＋ ┃ ＋ ┃ － ┃ ＋ ┃典型中间型 － ┃ ＋ ┃ － ┃ ＋ ┃非典型中间型 ━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━ － ┃ － ┃ ＋ ┃ ＋ ┃典型产气肠杆菌 ＋ ┃ － ┃ ＋ ┃ ＋ ┃非典型产气肠杆菌 ━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━ 如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做 重复试验。 7.5 结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为＋＋ －－或－＋－－,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN 值。 8 大肠菌群固体培养基测定法 8.1 样品制备同第4章。 8.2 计数 8.2.1 选取适宜的三个连续稀释度的样品液,每个稀释度接种两个灭菌平皿,每皿1mL。 另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中,作空白对照。 8.2.2 将冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)10～15mL倾注于每个平皿中。小 心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀。 8.2.3 待琼脂凝固后,再加3～4mL VRBA覆盖平板表层。 8.2.4 翻转平板,置于36±1℃培养18～24h。 8.2.5 选用有30～150个菌落的平板,计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。典型菌落为 紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为0.5mm或更大。 8.2.6 证实 8.2.6.1 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,移种于BGLB肉汤管内, 36± 1℃培养24h和48h,观察产气情况。 8.2.6.2 将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管,应进行革兰氏 染色,以便排除革兰氏阳性杆菌。 8.2.7 结果报告 经最后证实为阳性(产气,革兰氏阴性杆菌) 的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平 板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每克(毫升)样品中大肠菌群数。 例：10**-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接 种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为： 100×6/10×10**4/g(mL)＝6.0×10**5/g(mL) 附 录 A 培养基和试剂 (补充件) A1 月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤 胰蛋白(月示)或胰酪胨(Trypticase) 20g 氯化钠 5.0g 乳糖 5.0g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.75g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.75g 月桂基硫酸钠 0.1g 蒸馏水 1000.0mL 将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中,每管10mL。 121℃高压灭菌15min。最终pH6.8±0.2。 A2 煌绿乳糖胆盐(BGAB)肉汤 蛋白胨 10.0g 乳糖 10.0g 牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液 200.0mL 0.1％煌绿水溶液 13.3mL 蒸馏水 将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于 200 mL蒸馏水中,pH7.0～7.5),用蒸馏水稀释到975mL,调pH7.4。再加入0.1％煌绿水溶 液13.3mL,用蒸馏水补足到1000mL,用棉花过滤后,分装到20mm×150mm试管(管内有倒立 的小发酵管)中,每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH7.2±0.1。 A3 EC肉汤 胰蛋白(月示)或胰酪(月示) 20.0g 3号胆盐或混合胆盐 1.5g 乳糖 5.0g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 4.0g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.5g 氯化钠 5.0g 蒸馏水 1000.0mL 将以上成分溶解于蒸馏水中,分装16mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管),每管 8mL。121℃高压灭菌15min,最终pH6.9±0.1。 A4 伊红美蓝琼脂(EMB) 蛋白胨 10.0g 乳糖 10.0g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.0g 琼脂 15.0g 伊红γ(水溶性) 0.4g或2％水溶液20mL 美蓝 0.065g或0.5％水溶液13mL 蒸馏水 1000.0mL 在1000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂,加水补足至原量。分装于三角烧 瓶中。每瓶100mL或200mL,高压灭菌15min。最终pH7.1±0.2。使用前将琼脂融化,于每 100mL琼脂中加5mL灭菌的20％乳糖水溶液、2mL的2％伊红γ水溶液和1.3mL0.5％的美蓝水 溶液,摇匀,冷至45～50℃倾注平皿。 A5 营养琼脂斜面 牛肉膏 3.0g 蛋白胨 5.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000.0mL 将各成分加于蒸馏水中,煮沸溶解。分装合适的试管。121℃高压灭菌15min。最终 pH7.3±0.1。灭菌后摆成斜面备用。 A6 色氨酸肉汤 胰胨或胰酪胨 10.0g 蒸馏水 1000.0mL 加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。分装试管,每管5mL。121℃高压灭菌15min。 最终pH6.9±0.2。 A7 MR-VP培养基 (月示)胨 7.0g 葡萄糖 5.0g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 5.0g 蒸馏水 1000.0mL 将各成分溶于蒸馏水中,分装试管,121℃高压灭菌15min,最终pH6.9±0.2。 A8 Koser氏枸椽酸盐肉汤 磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4·4H2O) 1.5g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 1.0g 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.2g 枸椽酸钠(含2H2O) 3.0g 蒸馏水 1000.0mL 将各成分溶解于蒸馏水中,分装试管,每管10 mL,121℃高压灭菌15min。最终pH6.7 ±0.2。 A9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA) 蛋白胨 7.0g 酵母膏 3.0g 乳糖 10.0g 氯化钠 5.0g 胆盐或3号胆盐 1.5g 中性红 0.03g 结晶紫 0.002g 琼脂 15～18g 蒸馏水 1000.0mL 将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调至pH7.4±0.1。煮沸2min,将 培养基冷至45～50℃倾注平板。临用时制备,不得超过3h。 A10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液 贮存液 磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0g 蒸馏水 500mL 将磷酸二氢钾溶于蒸馏水中,用1 mol/L****约175 mL调至pH7.2。用蒸馏水加至 1000mL贮存于冰箱。 稀释液 取贮存液1.25mL, 用蒸馏水稀释至1000mL,分装于合适容器后,121℃高压灭菌15min。 A11 生理盐水 氯化钠 8.5g 蒸馏水 1000.0mL 将氯化钠溶于蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。 A12 革兰氏染色液 结晶紫染色液： 结晶紫 1.0g 95％乙醇 20.0mL 1％草酸铵水溶液 80.0mL 将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。 革兰氏碘液： 碘 1.0g 碘化钾 2.0g 蒸馏水 300.0mL 将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至 300mL。 沙黄复染液： 沙黄 0.25g 95％乙醇 10.0mL 蒸馏水 90.0mL 将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。 染色法 a. 将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染1min,水洗。 b. 滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。 c. 滴加95％乙醇脱色约15～30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。 d. 滴加复染液,复染1min,水洗、待干、镜检。 结果：革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。 A13 Kovacs氏靛基质试剂 对二甲氨基苯甲醛 5.0g 戊醇 75.0mL 盐酸(浓) 25.0mL 将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中,然后慢慢加入浓盐酸即可。 A14 甲基红指示剂 甲基红 0.1g 95％乙醇 300mL 将甲基红溶解于300mL乙醇中,加水稀释至500mL。 A15 Voges-Pros kauer(V-P)试剂 甲液 α-萘酚 5.0g 无水乙醇 100.0mL 乙液 氢氧化钾 40.0g 用蒸馏水加至 100.0mL 附 录 B 1g检样中最近似值(MPN)表 (补充件) 使用三管法,接种量分别为0.1,0.01和0.001g。 ━━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━ 阳 性 管 数 ┃ ┃ 阳 性 管 数 ┃ ━━━━━━━━━┫ MPN ┣━━━━━━━━━━┫ MPN 0.1 0.01 0.001 ┃ ｜ 0.1 0.01 0.001 ┃ ━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━ 0 0 0 ┃ ＜3 ┃ 2 0 0 ┃ 9.1 0 0 1 ┃ 3 ┃ 2 0 1 ┃ 14 0 0 2 ┃ 6 ┃ 2 0 2 ┃ 20 0 0 3 ┃ 9 ┃ 2 0 3 ┃ 26 0 1 0 ┃ 3 ┃ 2 1 0 ┃ 15 0 1 1 ┃ 6.1 ┃ 2 1 1 ┃ 20 0 1 2 ┃ 9.2 ┃ 2 1 2 ┃ 27 0 1 3 ┃ 12 ┃ 2 1 3 ┃ 34 0 2 0 ┃ 6.2 ┃ 2 2 0 ┃ 21 0 2 1 ┃ 9.3 ┃ 2 2 1 ┃ 28 0 2 2 ┃ 12 ┃ 2 2 2 ┃ 35 0 2 3 ┃ 16 ┃ 2 2 3 ┃ 42 0 3 0 ┃ 9.4 ┃ 2 3 0 ┃ 29 0 3 1 ┃ 13 ┃ 2 3 1 ┃ 36 0 3 2 ┃ 16 ┃ 2 3 2 ┃ 44 0 3 3 ┃ 19 ┃ 2 3 3 ┃ 53 ━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━ 1 0 0 ┃ 3.6 ┃ 3 0 0 ┃ 23 1 0 1 ┃ 7.2 ┃ 3 0 1 ┃ 39 1 0 2 ┃ 11 ┃ 3 0 2 ┃ 64 1 0 3 ┃ 15 ┃ 3 0 3 ┃ 95 1 1 0 ┃ 7.3 ┃ 3 1 0 ┃ 43 1 1 1 ┃ 11 ┃ 3 1 1 ┃ 75 1 1 2 ┃ 15 ┃ 3 1 2 ┃ 120 1 1 3 ┃ 19 ┃ 3 1 3 ┃ 160 1 2 0 ┃ 11 ┃ 3 2 0 ┃ 93 1 2 1 ┃ 15 ┃ 3 2 1 ┃ 150 1 2 2 ┃ 20 ┃ 3 2 2 ┃ 210 1 2 3 ┃ 24 ┃ 3 2 3 ┃ 290 1 3 0 ┃ 16 ┃ 3 3 0 ┃ 240 1 3 1 ┃ 20 ┃ 3 3 1 ┃ 460 1 3 2 ┃ 24 ┃ 3 3 2 ┃ 1100 1 3 3 ┃ 29 ┃ 3 3 3 ┃＞1100 ━━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━━━━━━┻━━━━ 注: ①本表采用3个稀释度 [0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)],每个稀释度接种3管。 ②表内所列检样量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时,表内数字应相应降低10 倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)时,则表内数字应相应增加10倍,其余 类推。 ━━━━━━━━━━━ 附加说明： 本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。 本标准由中华人民共和国秦皇岛进出口商品检验局、安徽进出口商品检验局、山西进 出口商品检验局负责起草。 本标准主要起草人李桂生、汤鹏飞、于桂华。 本标准主要参考美国公职分析化学家协会(AOAC)法定分析方法第14版第46章(1984年)。 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 中华人民共和国国家进出口商品检验局1992-12-28批准 1993-05-01实施
回答者：网友
