利用葡聚糖凝胶分离蛋白

葡聚糖凝胶（Polydextran），商品名称是Sephadex Polydextran几乎不溶于溶剂中，亲水性强，能迅速在水和电解质溶液中膨胀，在碱性的环境中十分稳定，所以可以用碱去除凝胶上的污染物。 Sephadex G-X，X表示葡聚糖的交联程度，数值越大则交联度越小，但吸水量越高，X值大致是吸水量的10倍。以Sephadex G-25为例，表示1克干燥的G-25凝胶可以吸水2.5 ml。 Sephadex的分离范围与填料粒经和交联度密切相关，大概范围如下： 型号 粒度（微米）有效分离范围（球形蛋白质） G 10 55－166 <700 G 15 60-180 <1500 G 25 - 1000-5000 G 50 - 1500-30000 G 75 - 3000-80000 G 100 - 4000-150000 G 150 - 5000-300000 G 200 - 5000-600000 Superdex属于葡聚糖以共价结合到交联多孔琼脂糖珠体上的球形凝胶，流速快、反压低。 型号 粒度（微米）有效分离范围（球形蛋白质） Superdex 30 24-44 <10000 Superdex 75 24-44 3000-70000 Superdex 200 10000-600000 操作实例（转载） 1） 凝胶溶胀 凝胶颗粒要求大小比较均匀，可流速稳定，结果较好。取葡聚糖Sephardex G-75干粉，加过量的蒸馏水室温充分溶胀一天（溶胀时间因凝胶交联度不同而不同），或沸水浴中溶胀3小时，这样可大大缩短溶胀时间，而且可以杀死细菌和霉菌，并可排出凝胶内气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的细小颗粒，最后凝胶经减压抽气除去气泡，即可准备装柱。 2）装柱与平衡 装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出，将层析柱垂直装好。关闭出口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后在搅拌下，将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉降约2—3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。装柱要求连续、均匀、无气泡、无“纹路”。将洗脱剂与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱相连。通过2—3倍柱床容积的洗脱液使柱床平衡，然后在凝胶表面上放一片滤纸或x龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。 3）上样与洗脱 样品上柱是实验成败的关键之一，若样品稀释或上柱不均，会使区带扩散，影响层析效果。上样时应尽量保持床面的稳定。先打开柱的出口，待柱中洗脱液流至距床表面1－2mm时，关闭出口，用滴管将1ml样品慢慢地加至柱床表面，应避免将床面凝胶冲起，打开出口并开始计算流出体积，当样品渗入床中接近床表面1mm时关闭出口。按加样操作，用少量（约1ml）洗脱液冲洗管壁2次。最后加入少量洗脱液于凝胶上，使高出床表面3－5cm，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒流泵，调好流速，以每管3ml/10min流速开始洗脱。上样的体积，分析用量为柱床容积的1-2%；制备用量为柱床容积的20%~30%。 4）收集与鉴定 用自动部分收集器收集流出液，每管4ml，紫外检测仪280nm波长处检测，最高的一个OD值时的体积即为吸收峰的洗脱体积Ve。 5）凝胶柱的处理 凝胶用过后，反复用蒸馏水洗后保存，如果有颜色或比较脏，可用0.5mol/LNaCl洗涤。短期可保存在水相中，加入防腐剂或加热灭菌后于低温保存。建议长期用干燥状态保存。 计算 分子量的测定和计算，一般都采用标准曲线法。只要测得几种标准蛋白质相对分子质量的Ve，并以它们的相对分子质量的对数(logMr)对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，即可从图中确定它的相对分子质量。 注意事项 各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。 可选用0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液洗涤。

采用UV，HPLC等测试方法研究了含微结构的葡聚糖凝胶（BHMs）对蛋白的浓缩分离性能。结果表明：含微结构的葡聚糖凝胶在室温下对牛血清蛋白的浓缩分离效率达95.3%以上，随温度的升高，浓缩分离效率降低，且当温度超过BHMs凝胶的低临界溶液温度(40℃)后，浓缩分离效率发生突变；和普通交联葡聚糖凝胶相比，通过控制流动相的温度，葡聚糖BHMs凝胶可实现对多种不同分子量蛋白的高效分离，提高了分离效率，分离时间由24h缩短至9h。吸水溶胀动力学以及SEM分析表明，BHMs凝胶的溶胀满足指数动力学方程，疏松多孔性结构及由其决定的温度敏感性是BHMs凝胶具备良好浓缩分离性能的原因。