硝酸还原酶的测定方法

硝酸还原酶活性的测定

原理

硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮

简单易行，在一般条件下都能做到。

红色的偶氮染料。反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行教附山钟素充。这种方法非常灵敏，能测定每ml含0.5μg的NaN饭把民让投难线类见O2。

仪器药品

721型响课端分光光度计 真空泵(或注射器)

保温箱 天平

真空来自干燥器 钻孔器

三角烧瓶 移液管

烧杯

0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5(见附表2)。

0.2mol/L KNO3:溶解20.22g KNO3于1000ml蒸馏水中。

磺胺试剂:1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。

α-萘话刻推跳东业位胺试剂:0.2gα-萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水中，稀释至100ml。

NaNO2标准溶液:1g NaNO2用蒸馏水溶解成360问答1000ml。然后吸取叶承何5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，此溶液每ml含剂慢圆序罗有NaNO2 5μg，用时稀程光算牛子独跳释之。

操作步骤

1. .将新鲜取回的叶片(蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可)水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用蒸馏水洗转满往定仍径涤2梍3次，吸干水分，然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.3-0.4g(或每份取50个圆片)，分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中:(1)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml+蒸馏水5ml;(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml+0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中(如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中)。将三角烧瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸

注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入30μg3-磷酸甘油醛或1，6-二磷酸果糖，能显著增加

保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，加入磺胺试剂2ml及α-萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，用比色计进行比色测

3. .绘制标准曲线

与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色金空限四松速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速上复府度相同，彼此可以比较。

吸取不同浓度的NaNO2溶液(例如5、4、3、2、1、0.5μg/ml)1ml夫氧保练谓当严女执客强于试管中，加入磺胺顾企社怎级极攻角集货哪试剂2ml及α-萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分似比款扬另名等否单当钟(或于一定温度的水俗中保温30分钟)，立即于分光光度计中进行测定，测定时的波因分搞前女宁差料落长为520nm，比色，读取吸光度或透光率。然后，以吸光度为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标。于语胶剂周架硫毫米方格纸上绘制吸光度-浓度曲线。

实验作业

1.试比较不同酸低然初般扩含植物的酶活性。

2.试比较取样前植物处于照光或黑暗条件下酶活性的不同。

参考文献

1.陈薇、张德颐:1980。植物组织中硝酸还原酶的提取测定和纯化，植物生理学通讯，1980(4):45-49。

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3.Hageman,R.H.and D.P. .Hucklesby:1971.Methods in Enzymology,23A:491-503.

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5.Snell,F.D.and C.T.Snell:1949.Colorimetric Methods of Analysis,Vol.II,802-807

(华东师范大学张志良)