避免荧光定量制亲轮错浓坐pcr检测技术的实验误差的方法如下:
样品的处理及选取
处理样品时,必须确保样品都得到了充分的处360问答理。选取实验样品时,要保证选取的组织尽可能的纯,不要污染其他组织,样品选好后,即可放入液氮或超低温冰箱保存。
核酸提取
加入液老阿质眼婷微氮研磨要彻底,蛋白、多糖、多酚类物质要去除干净,确保得到高质量的核酸,分光光度计检测核酸质量,RNA OD极维东五260/280=2.0左右,DNA OD260/280=1.8左右,最好再做电泳检测;同一样品要提取2到3个RNA,所剩余的样品不要丢弃,继续低温保存。
得到的RNA立即反转录为cDNA,RNA样品最好不要存放。
对于精度要求较高本想务歌和位政九独命的定量PCR,最好亚迅坐华龙阿亲鱼建先在样品的所有组织类型内做内参基因的稳定性分析,找到表定责乱统预刚孙怎酒送识达恒定基因作为内参。
做定量PCR时,先把除模板外的所有试剂预混,然后分装到PCR管中,分装时尽量采用排枪,加样时尽量采用料班侵座排枪。
体系中最好参入ROX参比荧光,消除光程差和加样的偏差。
重复操作
让重复操作最序部步按养冷灯水大的修正偏差。最有意义的重复是提取样品RNA时就重复,同一个样品,分别提取3份RNA,3份RNA都做反转录,所得的3份cDNA都做定量PCR检测,这样的重复之所以最有意式足技破义是因为我们把RNA提取、反转录、上机检测三步做了重复,这样得出的平均值要比只在上机检测时对同一cDNA样品做三个重复要有意义的多。
同一个cDNA样品做三个重复定量检测求平均值主要是消除加样时的误差,排枪加样时,误差很小,加样时的误差可以通过设几个重复检测出来。