什么是酶联免疫吸附试验?

酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验 (下简称ELISA) :酶免疫测定技术应用广技术其基本方法已知抗原或抗体吸附固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面使酶标记抗原抗体反应固相表面进行用洗涤法液相游离成分洗除常用 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法前者用于检测大分子抗原者用于测定特异抗体 自从Engvall和Perlman(1971)首次报道建立酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays, ELISA)来由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点使其得迅速发展和广泛应用 尽管早期ELISA由于特异性够高而妨碍了其实际应用步伐随着方法断改进、材料断更新尤其采用基因工程方法制备包被抗原采用针对某抗原表位单克隆抗体进行阻断ELISA试验都大大提高了ELISA特异性加之电脑化程度极高ELISA检测仪使用使ELISA更简便实用和标准化从而使其成广泛应用检测方法之 目前ELISA方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病诊断动物检疫方面ELISA猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等诊断已广泛采用标准方法 () 基本原理 ELISA方法基本原理酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合此种结合会改变抗体免疫学特性也影响酶生物学活性此种酶标记抗体与吸附固相载体上抗原或抗体发生特异性结合滴加底物溶液底物酶作用下使其所含供氢体由无色还原型变成有色氧化型出现颜色反应因此通过底物颜色反应来判定有无相应免疫反应颜色反应深浅与标本相应抗体或抗原量呈正比此种显色反应通过ELISA检测仪进行定量测定样酶化学反应敏感性和抗原抗体反应特异性结合起来使ELISA方法成种既特异又敏感检测方法 (二) 用于标记酶 用于标记抗体或抗抗体酶须具有下列特性:有高度活性和敏感性;室温下稳定;反应产物易于显现;能商品化生产目前应用较多有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等其HRP应用广 1.辣根过氧化物酶(HRP) 过氧化物酶广泛分布于植物辣根含量高从辣根提取称辣根过氧化物酶(HRP)由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉构成种糖蛋白(含糖量18%)分子量约40 000约由300氨基酸组成等电点pH 3-9催化反应适pH值因供氢体同而稍有差异般多pH 5左右此酶溶于水和50%饱和度下硫酸铵溶液酶蛋白和辅基大吸收光谱分别275nm和403nm 酶纯度RZ表示:RZ=OD403/OD275 纯酶RZ多3.0上高3.4RZ0.6下酶制品粗酶非酶蛋白约占 75%能用于标记RZ2.5上者方用于标记HRP作用底物过氧化氢催化反应时供氢体有几种:(1)邻苯二胺(OPD)产物橙色溶性敏感性高大吸收值490nm用肉眼观察判别容易被浓硫酸终止反应颜色数小时内改变,目前国内ELISA常用种;(2)联大茴香胺(OD),产物橘黄色大吸收值400nm颜色较稳定;(3)5-氨基水杨酸(5-AS):产物深棕色大吸收值449nm部分溶解敏感性较差;(4)邻联甲苯胺(OT)产物蓝色大吸收值630nm部分溶解稳定耐酸反应快颜色明显 2.碱性磷酸酶 系从小牛肠粘膜和大肠杆菌提取由多同功酶组成们底物种类多常用者硝基苯磷酸盐廉价无毒性酶解产物呈黄色溶大吸收值400nm酶活性pH10反应系统37℃1分钟水解1μg磷酸苯二钠单位 (三) 抗体酶标记方法及标记效测定 1.标记方法 良好酶结合物取决于两条件:即高效价抗体和高活性酶抗体活性和纯度对制备标记抗体至关重要因特异性免疫反应随抗体活性和纯度增加而增强酶标记过程抗体活性有所降低故需要纯度高、效价高及抗原亲和力强抗体球蛋白好使用亲和层析