jc1线粒体膜电位用流式细胞仪检查阳性cccp对照组和正常对照组染出来都是一样的，呈现双阳性，请问

回答 1）原理：JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)△Ψm 的理想荧光探针。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生橙色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。 （2）材料与仪器 JC-1购自Sigma公司，分子量652.23，用DMSO溶解，储存浓度为5 mg/ml，终浓度稀释成10 µg/ml; 荧光显微镜，多功能荧光酶标仪 （3）步骤 ① 接种细胞：96孔板，接种细胞数为每孔1.5万；或内置盖玻片的24孔板，每孔细胞数为9万。 ② 处理：接种24小时后用有糖earle’s 液洗两遍, 给予相应处理（氧化应激或药物）。 ③ JC-1孵育：用有糖earle’s 液洗1遍，并换上终浓度为10µg/ml JC-1培养箱孵育20 min. ④ 检测：用有糖earle’s 液洗2遍，盖玻片可在荧光显微镜下检测荧光变化，96孔板在多功能荧光酶标仪检测荧光值，检测JC-1单体时激发光设置为488nm，发射光设置为530nm；检测JC-1聚合物时，激发光设置为529nm，发射光设置为590nm （4）注意点 稀释JC-1时要迅速，否则易聚集，不易溶解；建议用碧云天的JC-1线粒体膜电位检测试剂盒。 稀释JC-1时要迅速，否则易聚集，不易溶解；建议用碧云天的JC-1线粒体膜电位检测试剂盒。 提问 不需要步骤 不需要步骤 回答 流式细胞仪检测的是相对值，所以必须要有各种对照来设定机器的参数和阈值。这个清单比较长。就你说的这三种，我可以展开说一下。 一般用荧光标记的抗体染色后，样本有可能会出现两个细胞群，一个阳性，一个阴性的，这样的很好判断。另外一种情况，就是整个细胞群的信号在染色后发生了漂移，但是看不出阳性和阴性的分界。这时候，对照的作用就体现出来了。 所谓空白对照，就是没有用荧光抗体染色的样本，上机检测后，也会得到信号。这时候要调节PMT（也就是检测器）的电压，这样对信号的扩增就会发生变化。这个酶染色的样本，就把信号置于最低的位置。如果是对数比例的信号轴，一般是置于10的3次方以下的位置。 而阴性对照，就是已知没有可被抗体识别靶分子的样本。用荧光抗体染色后，信号应该和空白对照相似。如果有很大的不同，说明抗体的非特异性结合很高，或者染色的步骤有问题。 而阳性对照，就是用已知肯定会有被抗体识别的靶分子的样本。用荧光抗体染色后，应该会出现较强的信号。这个样本有两个作用，一是出现强信号后，可以适当调节PMT的电压，让信号都位于可检测范围之内。另外，如果没有出现预期的信号，那可能是抗体失效，或者染色方法有问题。那检测的其他样本的结果也就无效了。 提问 我不是需要步骤，说明书有的，但是我做出来结果有点不对，请问什么原因？ jc1线粒体膜电位用流式细胞仪检查阳性cccp对照组和正常对照组染出来都是一样的，呈现双阳性，请问这是什么原因呢 我不是需要步骤，说明书有的，但是我做出来结果有点不对，请问什么原因？ jc1线粒体膜电位用流式细胞仪检查阳性cccp对照组和正常对照组染出来都是一样的，呈现双阳性，请问这是什么原因呢 回答 旁人可能觉得你们有感情基础，而你又愿意来相亲所以觉得是十有八九的事，结果你不愿意很意外，所以有许多废话出来，你愿意解释就解释，不想解释也可不必挂在心上。 提问 老师，十字门画法，阳性对照cccp组合正常对照对照出现在右上象限，一般来说cccp组诱导膜电位降低，不应该都出现在第二象限呀？ 老师，十字门画法，阳性对照cccp组合正常对照对照出现在右上象限，一般来说cccp组诱导膜电位降低，不应该都出现在第二象限呀？ 回答 一）呼吸抑制剂：这类抑制剂抑制呼吸链的电子传递，也就是抑制氧化，氧化是磷酸化的基础，抑制了氧化也就抑制了磷酸化。呼吸链某一特定部位被抑 制后，其底物一侧均为还原状态，其氧一侧均为氧化态，这很容易用分光光度法（双波长分光光度计）检定，重要的呼吸抑制剂有以下几种。 鱼藤酮（rotenone）系从植物中分离到的呼吸抑制剂，专一抑制NADH→CoQ的电子传递。 抗霉素A（actinomycin A）由霉菌中分离得到，专一抑制CoQ→Cyt c的电子传递。 CN、CO、NaN3和H2S均抑制细胞色素氧化酶。 （二）磷酸化抑制剂：这类抑制剂抑制ATP的合成，抑制了磷酸化也一定会抑制氧化。 寡霉素（oligomycin）可与F0的OSCP结合，阻塞氢离子通道，从而抑制ATP合成。 二环己基碳二亚胺（dicyclohexyl carbodiimide，DCC）可与F0的DCC结合蛋白结合，阻断H+通道，抑制ATP合成。栎皮酮（quercetin）直接抑制参与ATP合成的ATP酶。 （三）解偶联剂（uncoupler）：解偶联剂使氧化和磷酸化脱偶联，氧化仍可以进行，而磷酸化不能进行，解偶联剂作用的本质是增大线粒体内 膜对H+的通透性，消除H+的跨膜梯度，因而无ATP生成，解偶联剂只影响氧化磷酸化而不干扰底物水平磷酸化，解偶联剂的作用使氧化释放出来的能量全部以 热的形式散发。动物棕色脂肪组织线粒体中有独特的解偶联蛋白，使氧化磷酸化处于解偶联状态，这对于维持动物的体温十分重要。 常用的解偶联剂有2，4-二硝基酚（dinitrophenol，DNP），羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼（FCCP），双香豆素（dicoumarin）等，过量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶联，从而使体温升高。 过量的甲状腺素也有解偶联作用，甲状腺素诱导细胞膜上Na+-K+-ATP酶的合成，此酶催化ATP分解，释放的能量将细胞内的Na+泵到细胞 外，而K+进入细胞，Na+-K+-ATP酶的转换率为100个分子ATP/秒，酶分子数增多，单位时间内分解的ATP增多，生成的ADP又可促进磷酸化 过程。甲亢病人表现为多食、无力、喜冷怕热，基础代谢率（BMR）增高，因此也有人将甲状腺素看作是调节氧化磷酸化的重要激素。 提问 做了阴性对照组，没有加任何染料，cccp组试剂里面自带可以降低膜电位，和空白对照组加了jc-1染料 做了阴性对照组，没有加任何染料，cccp组试剂里面自带可以降低膜电位，和空白对照组加了jc-1染料 回答 比如测定一种药品对小鼠的作用，实验组小鼠的饲料中加了这种药物，那就得在相同的实验条件下饲养一组不加药品的小鼠作为阴性对照，这样，如果出现了明显的不同，说明就是这种药物导致的。 阴性对照是用来排除其他实验因素对结果的影响。 更多42条 