双重荧光定量PCR探针荧光基团该怎么选择

荧光定量PCR法检测的是SYBR Green掺入到双链DNA中的量。
　　SYBR Green掺入到双链DNA中后会发出荧光。
　　但是只要是双链，它都掺。
　　而探针法是当探针结合到目标序列上以后，聚合酶降解探针后，探针上自带的荧光基团离开淬灭基团，从而发出荧光。
　　从两者的原理上来看，不难判断，荧光PCR法更加简单方便，而且成本低。
　　而探针法特异性更强。
　　所选序列应该高度特异。
　　应该选择具有最小二级结构的扩增子。
　　这是很重要的，因为二级结构会影响反应效率。
　　在任何实时应用中期望获得100%的扩增反应效率，这意味着每次循环中，体系内的扩增子都有两倍的增加。
　　如果二级结构在热力学上比寡聚目的基因更稳定，那目的基因的杂交将会失败。
　　二级结构还会阻碍酶的扩增。
　　如果扩增子的二级结构不能避免，则引物的退火温度要相应提高。
在整个过程中，要进行BLAST和类似的分析，以确保特异性。