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大鼠灌注取脑；用途：；1.用于常规HE染色，免疫组化分析；2.冰冻切片可以不做脑组织固定；3.不可用于westernblot和PCR；4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作；原理：；心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织；必要性：；1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易；2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤；3.脑内血液 大鼠灌注取脑 用途： 1. 用于常规HE染色，免疫组化分析。 2. 2.冰冻切片可以不做脑组织固定。 3. 3.不可用于western blot和PCR。 4. 4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。 5. 原理： 6. 心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。 7. 必要性： 8. 1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。 9. 2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。 10. 3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。 11. 大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)： 12. 流程： 13. 1) 麻醉 2)开胸 3)心脏左心室穿针,剪开右心耳 4)生理盐水冲水 5)4%多基甲醛固定 6)取脑 7)保存或切片. 14. 具体过程： 15. 大鼠经深度麻醉后，固定于自制的木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。 16. Tips： 17. 1.多聚甲醛的配置： 18. 一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。 19. 简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。 20. 2.制作灌注装置，用两瓶塑料包装的输液瓶装灌注液。同时配好输液器备用。 21. 3.10％水合氯醛按4mL/100g的剂量腹腔麻醉动物。 22. 4.沿两侧肋弓剪开皮肤，打开腹腔，用一血管钳夹持剑突并向上提拉，用弯剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸，然后向两侧顺延，剪断膈肌及肋骨，夹持剑突的血管钳将剑突连带胸廓上翻固定，充分暴露心脏，直视下穿刺针左心室心尖处，用血管钳固定。 23. 5.快速滴注生理盐水(室温)，同时剪开右心耳。约注入100~150mL，至流出液体血色较浅基本澄清，停止灌注。肝脏、眼珠、爪子迅速变白是排液的有效观察指标。 24. 6.继续用4%多聚甲醛灌流250ml固定。 25. 7.后固定：灌流后的脑组织置于4％PFA置4度冰箱内进行后固定，时间>2h，过夜最好。 26. 补充： 27. 还有一种省时省剂的方法。 28. 夹闭腹主动脉：只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又省试剂。先灌注生理盐水约100ml，见到老鼠两前肢及两肺变白可改灌注多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即可。 29. 灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动（下肢不抽动证明腹主动脉夹闭完全）；前肢及颈部僵硬；所灌注的脑组织白而硬。 30.
