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鼠鼠谓命科实验室明星功鼠鼠模型谓命科帮手能想自设计或解条件性基敲除鼠做结供家参考
条件性基敲除鼠设计利用Cre/LoxP或Flipe/Frt原理都位点特异性重组酶系统Cre/LoxP系统例比待敲除段目标DNA序列两端各放置loxP序列flox(flanked by loxP)鼠flox鼠与带细胞特异性表达Cre鼠交配繁殖获特定细胞目标基敲除掉鼠即条件性基敲除鼠外若与控制Cre表达其诱导系统(比CreERT2)相结合某基同实现空两面调控
Cre/loxP系统源于噬菌体介导位点特异DNA重组该系统含两组:段34bpDNA序列(LoxP序列)含两13 bp反向重复序列8 bp核序列 LoxP向由间8碱基决定段LoxP序列Cre重组酶识别位点 令组部Cre重组酶由噬菌体编码种由343氨基酸组蛋白Cre介导两LoxP位点重组引起两LoxP间DNA序列缺失Cre重组酶cDNA通基工程手段置于组织或细胞特异性启Cre组织/细胞特异性表达Cre鼠叫Cre工具鼠 跟Flox鼠交配条件性基敲除鼠
所谓Flox鼠指某基某外显两侧各放LoxP序列段序列Flanked by LoxP叫做Flox鼠种Flox鼠般要通设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、嵌合体鼠传代获种鼠跟Cre工具鼠交配由于Cre表达介导两LoxP位点序列重组敲除两LoxP间序列由于同Cre工具鼠Cre表达组织/细胞特异性达同组织、细胞特异性敲除目基目标比皮细胞、胸腺细胞、T细胞、B细胞、肌细胞、肠道、肺脏等
何设计条件性基敲除鼠呢?所说设计主要Flox鼠设计所谓条件性敲除说除特定细胞外其细胞面没任何基表达异般情况要第外显前面放置LoxP序列第外显前面般启放置LoxP序列能破坏或改变启性条件性敲除般敲掉早引起移码突变外显要敲除起始密码ATG外显否则基能利用ORF内ATG编码缺少部N端序列蛋白蛋白能全部或部野蛋白功能选择要敲除外显候(各放LoxP外显两侧)该外显碱基数目能3N否则新基pre-RNA拼接mRNA能产移码突变产与野蛋白相比少段间序列新蛋白外显碱基数目3N+1或3N+2敲除外显产移码突变达基敲除目筛选要敲除(Floxed)外显候般游外显始筛选适合敲除外显需要注意般dna析软件能确定内含外显边界需要仔细核95%边界遵循gt/ag边界原则Ensembl查基外显内含网站结绝部确需要仔细核毕竟基敲除鼠研发间比较程需要特别前期做少考虑都嫌些原则般课题考虑特殊情况需要特殊处理
