最近从别的老师那里拿到了拟南芥的突变体扒嫌种子，突变体的名称是SA适左月析元注米普笑IL_244_D02，这是一个T-DNA插入导致拟南芥基因CBF3沉默的突变体种子。因为大实验室中拟南芥的种子非常多，存在弄混的可能且需火见溶要鉴定种子是杂合体还是纯合体。所以在做后续的实验之前，来自必须要对突变体种子进行鉴定。对于T-DNA插入型突变体的鉴定可以通过三引物法来实现。
2 三引物法鉴定突变搞散由可执弦体的原理
2.1 关于Ti质粒和T-DNA
Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。人们根据这一现象，将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。
2.2 关于三引物法
PCR方法为鉴定纯合突度际反材皇船老期乡变体提供了有利手段。素画与李它利用三个引物LP、RP和BP，其中LP和RP是植物基因组上T-DNA插入位点两测的引物，BP是T-DNA区段上的引物。
经过PCR，在野生型川笑考倒块四任集植株，LP和RP这对引物扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大带）；在杂合突变体，LP和RP能扩增出分子量较大的产辩并物（野生型基因，大带），另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物（小带）；脱吧的农适径督线口往在纯合突变体，只有BP和RP能扩增出分子量较小的产物（小带）。
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十依她济因此，利用以上三种引物做PCR，根据扩增结果能够容易地从群体中区分出纯合突变体。T-DNA本身的长度约为17kb，插入之后会阻抑两端引物的扩增产物的形成。WT去身工己硫烧乡印货检为野生型植株，HZ为杂合突变体植株，HM为纯合突变体植株。
野生型WT：LP+RP（大片段）
杂合突变体HZ：LP+RP（大片段）、BP+RP（小片段）
纯合突变体HM：BP+RP（小片段）
注意SALK系列突变体用LBb1.3, SAIL系列突变体用LB3，至于为什么，参考“T-设因宣DNA Primer Design ”这个网站的说明，这个网站后面会用到。
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PS: 因为我的种子是SAIL系列，所以BP用的是LB3，因为我顺着图片下方的链接下载了 [SAIL 亚pCSA110 & pDAP101 T-DNAs]这个文件，发现文件中说了“We did all 武策底叫主协密问喜of our sequencing with LB3”，然后恰好我变话势机列使随复龙破们实验室的引物库里有LB3，简直皆大春灶手欢喜（笑）~
但是我不知道LB1,2,3 的差别在哪里，因为这个说明中的 SAIL 汉未王钢香助lines 我没搞懂是什么，也不知道“We did all of our sequencing with LB3”是指什么。有知道的师兄师姐麻烦告诉我一下哈~
3 实操设孙工区型更另氢计LP和RP
解决差飞响形草洋沉团BP的问题后，开始设计LP和RP。首先直接进入T-DNA Primer Design “http://signal.***.edu/tdnaprimers.2.html”这个网站，然后拉到下面，在对话框里输入突变体的名称就可以了。
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我直接输入了“SAIL_244_D02”，然后点Submit。然后就会出来LP和RP，以及product size。我的Safari网站弹出来的结果是一长串的，不好截图，就没放全部啦~
