细胞周期检查点的调控内容

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1: DNA损伤检查点(DNAdamage checkpoint) 负责查看DNA有无损伤;
2:DNA复制检查点(DNAreplication checkpoint) 负责DNA复制的进度;
3:纺锤体组装检查点(spindleassembly checkpoint) 管理染色体的正确分配已否,因为染色体的分配主要依赖于纺锤体的作用。 以有丝分裂方式增殖的细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束所经历的过程。这一过程周而复始。细胞周期是50年代细胞学上重大发现之一。在这之前认为有丝分裂期是细胞增殖周期中的主要阶段,而把处于分裂间期的细胞视为细胞的静止阶段。1951 年霍华德等用P-磷酸盐标记了蚕豆根尖细胞,通过放射自显影研究根尖细胞DNA合成的时间间隔,观察到P之掺入不是在有丝分裂期,而是在有丝分裂前的间期中的一段时间内。发现间期内有一个DNA合成期(S期),P只在这时才掺入到DNA;S期和分裂期(M期)之间有一个间隙无P掺入,称为G2期,在M期和S期之间有另一个间隙称为G1期,G1期也不能合成DNA。
细胞生命活动大部分时间是在间期度过的,如大鼠角膜上皮细胞的细胞周期内,间期占14000分钟。分裂期仅占70分钟。细胞周期各阶段都有复杂的生化变化。间期是细胞合成DNA、RNA、蛋白质和各种酶的时期,是为细胞分裂准备物质基础的主要阶段。
在一个增殖的细胞群中,所有细胞并非是同步增殖的,它们在细胞周期运行中,可能有四种命运:
①细胞经M期又开始第二次周期;
②停止于G2期,称为G2期细胞(R2),它受某种刺激后可进入周期;
③停止在G1期,称为休止细胞或G0期细胞,这类细胞受某种刺激后仍能进入周期,继续进行有丝分裂;
④丧失生命力近于死亡的细胞,称为丢失细胞,或称不再分裂的细胞。继续分裂的细胞沿着细胞周期从一个有丝分裂期到下一个分裂期。不再分裂的细胞离开了细胞周期不再分裂,最终死亡。 细胞体积逐渐增大,制造RNA(包括tRNA,mRNA,rRNA以及核糖体等)。RNA的合成又导致结构蛋白和酶蛋白的形成,这些酶又控制着形成新细胞成分的代谢活动。G1又分为G1早期和G1晚期两个阶段;细胞在G1早期中合成各种在G1期内所特有的RNA和蛋白质,而在G1晚期至S期则转为合成DNA复制所需要的若干前体物和酶分子,包括胸腺嘧啶激酶、胸腺嘧啶核苷酸激酶、脱氧胸腺嘧啶核苷酸合成酶等,特别是DNA聚合酶急剧增高。这些酶活性的增高对于充分利用核酸底物在S期合成DNA是不可少的条件。
G1期持续时间变异很大,多数细胞的G1期较长,是与细胞需要增加质量有关。但在某些单细胞生物如大变形虫、四膜虫和多细胞生物的某些细胞(如海胆胚胎,小鼠胚胎细胞)则无G1期,中国仓鼠卵巢细胞的变异株无G1和G2期,以致M期和S期连接在一起。G1期的长短之所以变化很大,与G1期内存在一个校正点或阻止点(简称R点)有关。R点主要控制 G1期时间的长短。通过了此点,细胞就能以正常速度不受外界条件的影响而完成细胞周期的其他时期。因此,有人认为细胞的生长是在G1期R点上停止的,例如当细胞内环腺苷酸(cAMP)水平增高,细胞密度增加时,可阻止细胞从G1期向S期过渡,用嘌呤霉素抑制蛋白质合成或用放射线菌素D抑制RNA合成,也能延缓细胞从G1期进入S期。有人发现 G1期内能合成一种有触发作用的蛋白质;它是不稳定的,极易被分解,故称为v蛋白。v蛋白在G1细胞中达到一定水平时,细胞便可通过R点进入S期。
细胞进入G1期后,并不是毫无例外地都进入下一期继续增殖,在此时可能会出现三种不同前景的细胞:①增殖细胞:这种细胞能及时从G1期进入S期,并保持旺盛的分裂能力。例如消化道上皮细胞及骨髓细胞等;②暂不增殖细胞或休止细胞:这类细胞进入G1期后不立即转入S期,在需要时,如损伤、手术等,才进入S期继续增殖。例如肝细胞及肾小管上皮细胞等;③不增殖细胞:此种细胞进入G1期后,失去分裂能力,终身处于G1期,最后通过分化、衰老直至死亡。例如高度分化的神经细胞、肌细胞及成熟的红细胞等。 在这一阶段完成DNA的合成以及合成与DNA组装构成染色质等有关的组蛋白。DNA含量在此时期增加一倍。S期终结时,每一染色体复制成两个染色单体(Hole,1979)。生成的两个子代DNA分子与原来DNA分子的结构完全相同。一个人体细胞核直径10~20微米,其中DNA含量为10克,如拉成一根DNA链,长度可达3米。哺乳类动物细胞S期一般为6~8小时。DNA的复制能在几小时内完成,主要是由于DNA链分成许多的复制单位(复制子)(可多达10000个左右),它们可在S期的不同时间分别复制。另外,在S期内还有组蛋白的合成──组蛋白基因在G1-S期之间活化,组蛋白mRNA的转录增大,并在整个S期内连续进行。已合成的组蛋白使新合成的DNA很快转为核组蛋白复合体。
S期细胞含有一种因素能诱导DNA合成,用细胞融合实验证明,G1细胞在与S期细胞融合后能加速其核内DNA复制的起点启动。S期不同阶段复制的DNA碱基组成是不同的,早期复制的DNA富有G-C碱基,晚期复制的DNA富有A-T碱基,即常染色质比异染色质复制较早。 从检查点的工作方式来看,又可分为三个部分
1:探测器(sensor), 负责检查质量问题;
2:传感器(signaltransducer), 负责信号传递;
3:效应器(effector), 由效应器去中断细胞周期进程并开动修复机制。 Ⅰ、样品准备
A、组织单细胞悬浮液(如淋巴腺、脾、骨髓、胎盘细胞)
B、组织培养细胞
C、Ficoll-hypaque分离的单核细胞
Ⅱ、反应体系-DNA低渗缓冲液
柠檬酸三钠 0.25g
Triton-X 100 0.75ml
Propidium iodide 0.025g
核糖核酸酶0.005g
蒸馏水250ml
我们将该DNA低渗溶液于密闭瓶子中存放数月后并无发现有任何染色活性的丢失
Ⅲ、染色
1、 每一个管子中放入1×106个细胞;
2、 样品离心后尽可能完全地移去上清液,并且不要打碎沉淀块;
3、加入1ml的DNA低渗染色(可用甲基绿进行染色)缓冲液至沉淀中,并混匀;
4、 样品于4℃下避光30分钟或最长不超过1个小时以备流式细胞仪分析。
注意:延长在低渗缓冲液的曝光时间会引起样品碎片的增加。
细胞周期检测可以作为生物相容性评价指标,示例如下:应用体外细胞培养法,观察不同质量分数羟基磷灰石浸提液对L-929细胞的细胞学形态的影响,同时采用MTT比色法评价羟基磷灰石对L-929生长和增殖的影响,流式细胞仪检测羟基磷灰石浸提液对L-929细胞生长周期及凋亡的影响。结果表明,羟基磷灰石浸提液对体外培养的细胞形态无明显影响,对细胞生长和增殖无明显抑制作用;不同质量分数材料浸提液的细胞毒性为 0~1级,随羟基磷灰石浸提液质量分数的升高,细胞凋亡率逐渐上升;50%、75%、100%羟基磷灰石浸提液组能明显降低G0 /G1 期细胞比例,增加S,G2 /M期细胞比例,能增加L-929细胞DNA的合成,促进细胞生长和组织修复。


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