土壤木聚糖酶

木聚糖酶活性测定方法 （规范性附录） A 1 方法原理 样品的木聚糖酶对底物——燕麦木聚糖进行水解，用DNS（3，5－二硝基水杨酸）试剂分光光度法测定水解所产生的还原糖量。 A 2 活性单位定义 在温度为50℃，pH 5.3条件下，1s内从燕麦木聚糖中产生1nmol木糖所需的酶量，为1个木聚糖酶的活性单位（BXU）。 A 3 应用范围 本法用于来源于曲霉属（Aspergilious）或木霉属（Trichoderma）的木聚糖酶样品的测定。当分析其它来源的酶时，该法的线性需要校正。本法适用于各种含有木聚糖酶的产品。 A 4 测定条件 A 4.1 底物： 燕麦木聚糖 A 4.2 pH： 5.3 A 4.3 温度： 50℃±0.5℃ A 4.4 保温时间： 5min A 5 仪 器 A 5.1 超级恒温水浴锅：50℃ A 5.2 水浴锅： 100℃ A 5.3 旋涡磁力搅拌器 A 5.4 分光光度计：可在540nm下测定吸光度 A 5.5 分析天平：感量0.0001g A 6 试 剂 所有试剂溶液均需用去离子水配制。 A 6.1 柠檬酸缓冲液（0.05mol/l、pH5.3） 溶解10.5g柠檬酸（C6H8O7•H2O）于800ml水中，并用1mol/L****调pH至5.3，（消耗约110ml 1mol/L****），再用水定容至1000ml。 A 6.2 底物—1%燕麦木聚糖 称取1.0g燕麦木聚糖，溶于80ml 60℃柠檬酸缓冲液中，磁力搅拌加热至沸腾，继续搅拌冷却至室温，加盖缓慢搅拌过夜。用柠檬酸缓冲液定容至100ml。此底物溶液在4℃时最多保存一周，或将底物溶液分成等份在-20℃下冰冻保存，临用前融解，搅拌均匀使用。 A 6.3 DNS试剂 溶解50.0g 3，5二硝基水杨酸于4000ml水中，不断磁力搅拌，缓缓加入80.0g****，使之完全溶解，在继续磁力搅拌下，将1500g酒石酸钾钠分数次少量加入，并小心加热，溶液最高温度不超过45℃。冷却至室温后定容至5000ml。如溶液不澄清，用Wheatman1号滤纸过滤，然后室温保存于深色瓶中。 A 7 样品制备 精确称取样品1.0000g，置于研钵内，加入5ml的柠檬酸缓冲液，研磨片刻，放置30min后，用柠檬酸缓冲液稀释受检样品。调整稀释倍数使测定时产生的吸光度在0.10～0.40之间。 A 8 测定步骤 A 8.1 试样测定 分别向2支试管加入1.8ml底物溶液，置50℃水浴保温5min。在其中1支试管中加入200μl稀释酶样，磁力旋转搅拌均匀，置50℃水浴中，准确保温5min。分别加入3.0ml DNS试剂至2支试管中，搅拌均匀。在另一试管（空白管）中加入200μl缓冲液。同时将2支试管置入沸水浴准确保温5min，取出置入冷水中冷却至室温。在540nm处测量酶样对空白的吸光度，在酶活标准曲线上读取酶活，再乘以酶样稀释倍数。继续做2个重复测定。 A 8.2 标准曲线的制定 A 8.2.1 配制10μmol/ml木糖储备液 将150mg木糖溶解于柠檬酸缓冲液中，并用柠檬酸缓冲液定容至100ml。储备液可分成小量在-20℃下冰冻。使用前，融解并混合均匀。 A 8.2.2 配制标准稀释液 用缓冲液稀释储备液配制以下标准稀释液： 稀释比例 木糖(μmol/ml) 酶活(BXU/ml) 1+0 10.0 33.33 1+1 5.0 16.67 1+2 3.33 11.11 1+4 2.0 6.67 A 8.2.3 制备标准曲线 每种标准稀释液做2次重复测定。分别向2支试管中加入1.8ml底物溶液，50℃水浴保温5min。加入3.0mlDNS试剂和200μl标准稀释液，在沸水浴中准确保温5min，冷却后在540nm处测量样品对试剂空白的吸光度。以200μl柠檬酸缓冲液代替标准稀释液配制试剂空白。每批样品制备一次标准曲线。 A 9 测定结果的计算 木聚糖酶活性(BXU/g) = （木糖浓度*1000*稀释倍数）/（样品重量*反应时间300S）