原生质体活力测定的FDA染色法是怎样做的?

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FDA染色法:FDA是一种积累在活原生质体膜中的无荧光、无极性、可透过完整的原生质体膜的染料,能被荧光显微镜检测出来。

FDA一旦进入原生质体后,由于受到脂酶分解而产生有荧光的极性物质,因此有活力的、完整的细胞便产生黄绿色荧光,而无活力的原生质体不能分解FDA,因此无荧光产生。

FDA染色测活性的方法如下:取洗涤过的原生质体悬浮液0.5mL,置于10mm×100mm的小试管中,加入FDA溶液使其最终浓度为0.01%,混匀置于室温条件下5min后,用荧光显微镜观察,发荧光的原生质体为有活力的,不产生荧光的为无活力的。由于叶绿素的关系,叶肉原生质发黄绿色荧光的为有活力的,发红色荧光的为无活力的。

另外还有:(1)酚藏花红染色法(phenosafranine):使用酚藏花红时的终浓度为0.01%,它只能使无生命力的原生质体被染成红色,活的原生质体不能染色。

(2)荧光增白剂(calcofluor:white,CFW)染色法:荧光增白剂能够通过检测细胞壁再生的开始而确认原生质体的活力。荧光增白剂束缚新合成的细胞壁中的β-葡萄糖苷键,通过观察质膜周围的荧光环可以观察到细胞壁是否合成。当0.1mL原生质体与0.5μL的0.1g100mL的CFW溶液混合可以得到最佳染色效果。最后用培养基将原生质调到一定密度进行培养。一般原生质体的培养密度为10superscript4superscript10superscript6superscript个mL。


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