设计引物加接头，扩增目的基因，连接到T载体上测序。正确无误，切下来，酶切载体质粒与目的基因连接，阳性克隆鉴定，测序无误后构建完毕
载体构建
一．原理
依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体
DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
二．操作步骤
1． 摇菌
取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。
2． 提质粒
依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。
3． 酶切
按下表加入试剂。
反应所需试剂 体积（单位：ul）
质粒 10
所需内切酶反应缓冲液 2
所需限制性内切核酸酶 1
H2O 7
将加好的EP管置于37℃保温1-2h。（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）
4． 电泳检测
将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。
5． 连接
如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接，连接体系如下：
双蒸水 5μL
10×T4 DNA连接缓冲液 1μL
载体 2μL
酶切后的目的基因 1μL
T4DNA连接酶 1μL
总体积 10μL
置于温箱，12-16℃，保温8-16h
6． 转化
依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，
12-16h。
7． 单克隆检测
（1）挑单克隆
先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的
AMP，用枪头混匀；取1.5 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。
（2）单克隆检测
以每管摇好的菌液为模板，以原有的引物进行PCR，然后将PCR产物跑电泳，观察电泳图像中那几管的条带正确，将正确条带相对应管的菌液再抽取100μL，加到3ml（有LB液体培养液，AMP+）试管中，过夜摇；第二天重摇，将摇好的菌取1ml于1.5mlEP管中送测序，并保种。
注：①挑单克隆时，一定要挑单一圆润的菌落，有卫星斑的不挑。
②别忘记往培养基中加AMP。
③用接种环挑菌后，要在酒精灯上反复灼烧，然后再进行下一次挑菌。
三．注意事项
1． 连接产物可短时间在-20℃保存，使用时可以取出进行后续实验；
2． 在细胞转化时，冰浴和热激要严格控制好时间；
3． 连接反应是DNA重组过程中的关键步骤，其成败的重要参数之一就是温度，因此要控
制好连接温度。
4．进行黏末端连接时，会产生一定数量的载体自身环化分子，导致转化菌中过高的假阳性克隆背景。针对这一问题，常采用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）去掉载体的5’-磷酸以抑制DNA片段的自身环化。
参考：
刘进元，常智杰，赵广荣,等.分子生物学实验指导[M].北京:清华大学，2002
2. 周俊宜.分子生物学基本技能和策略[M].北京：科学，2003：117-120
3. 李海英，杨峰山，邵淑丽,等.现代分子生物学与基因工程[M].北京:化学工业，2008:138-142
4. 朱旭芬.基因工程实验指导[M].北京：高等教育，2006:134-139
