如何进行CCR5抑制剂Maraviroc的激酶实验跟细胞实验？

激酶实验: 趋化因子与 CCR5结合的抑制作用 使用稳定表达受体或膜及其制品的昆虫HEK-293细胞测量125I-标记的 MIP-1α, MIP-1β,和 RANTES 与CCR5结合情况。细胞按2 × 106 个细胞/ml的密度再悬浮在结合buffer (50 mM HEPES 含1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 和 0.5%牛血清蛋白[BSA]，调节pH为 7.4) 中。为了制备膜，PBS冲洗的细胞再悬浮在 裂解 buffer (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 片 COMPLETE /50 mL, pH 7.4)中，然后在Polytron 手持匀浆器中搅匀, 在40,000× g下超速离心30分钟，再悬浮在 结合 buffer中，蛋白浓度为0.25 mg/mL (96-孔板的每孔中含 12.5 μg 膜蛋白)。制备125I-放射性标记的 MIP-1α, MIP-1β, 和 RANTES ，在 结合 buffer中稀释，终浓度为400 pM。每孔加入Maraviroc 稀释液，终体积为100 μL, 实验板温育1小时, 通过预阻断和冲洗的 Unifilter 板过滤，计数，烘干过夜。 细胞试验: 细胞系 PHA刺激的PBMC或PM-1细胞 浓度 0-1 μM 处理时间 5天或7天 方法 在24孔组织培养板上进行药物敏感性试验。在DMSO中制备重复的8点连续稀释Maraviroc，实验中DMSO终浓度为 0.1% (vol/vol)。PHA刺激的PBMC或PM-1细胞感染细胞，在37oC下进行1小时。细胞随后稀释一次，3.6 × 105 PBMC 或2.0 × 105 PM-1细胞加到含稀释 Maraviroc的每孔中。实验板在37oC下在含5% CO2 (vol/vol) 环境下温育5天（实验室适应株）或7天（原始分离株）。所有实验中含Saquinavir (一种 HIV-1 蛋白酶抑制剂) 和RANTES。