脂肪酶活力的测定实验步骤？

脂肪酶活力的测定 [目的与原理] 掌握脂肪酶活力的测定方法，并测定鱼、虾、贝体内消化器官肝胰脏、胃、肠的脂肪酶活力。 脂肪酶在一定条件下，将甘油三酯水解。在不同水解阶段可分别产生脂肪酸、甘油二酯、甘油一酯及甘油。水解所产生的脂肪酸可以用标准的****滴定，用滴定值表示酶活力。 [试剂与器材] 试剂： 1、聚乙烯醇(P. V. P.)橄榄油乳化液：称取40克聚乙烯醇，加蒸馏水约1000毫升，在小火上加热，并不停搅拌，至聚乙烯醇全部溶解，冷却后定容至1000毫升。用双层纱布过滤，滤液备用。取4％聚乙烯醇溶液150毫升，加50毫升橄榄油，用高速组织捣碎机搅动6分钟，即成乳白色聚乙烯醇橄榄油乳化液，保存于低温下（4℃）备用。 2、0.025M磷酸缓冲液（pH7.5）。0.025M磷酸氢二钠溶液的配置：取Na2HPO4·2H2O 4.45g溶于1L蒸馏水中，0.025M磷酸二氢钠溶液的配置：取NaH2PO4·H2O 3.45g（或NaH2PO4·2H2O 3.90g）溶于1L蒸馏水中。将0.025M磷酸氢二钠84ml与0.025M磷酸二氢钠16ml混合，即为0.025M磷酸缓冲液。 3、0.05N****标准溶液 4、1％酚酞指示剂：取1g酚酞溶于100ml 70％乙醇溶剂中。 5、95％乙醇 材料： 鱼、虾、贝的肝胰脏、胃、肠标本。 器材： 匀浆器、离心机、恒温水浴。高速组织捣碎机、酸式滴定管、滴定管架、镊子、剪子、锥形瓶、移液管、烧杯。 [实验步骤] 1、酶粗提液的制备（见蛋白酶活力的测定）。 2、取100ml锥形瓶3个，一个作为对照组，另两个为测定组 对照组 测定组1 测定组2 0.025M磷酸缓冲液（pH7.5） 5ml 5ml 5ml 聚乙醇橄榄油乳化液 4ml 4ml 4ml 95％乙醇 15ml 40℃水浴预热5—10分钟 酶液 1ml 1ml 1ml 40℃水浴保温15分钟（精确计时） 95％乙醇 — 15ml 15ml 酚酞指示剂 3滴 3滴 3滴 用0.05N标准****滴定至微红色，记录滴定用去ml数。 计算： 酶活力以国际单位表示，即在一定条件下，脂肪酶水解脂肪每分钟产生1微克分子脂肪酸的酶量定为一个国际单位。 脂肪酶活力单位＝（A－B）N·f t 式中： A为样品耗碱液ml数， B为对照组耗碱液ml数 N为每毫升碱液微克分子数，f为稀释倍数 t为作用时间 (分) [方法评估] 测定脂肪酶活力的方法大致可分为3类：即测定产物（游离脂肪酸）的增加量（如滴定法、比色法、分光光度法、荧光法和pH电极法等）；测定底物的减少量（如比浊法、扩散法等）；测定脂酶的实际量（如放射免疫法和乳胶凝集法等）。本实验用滴定法测定脂肪酶活力，此法灵敏度较差，样品用量大，但所需设备较简单，可随时进行检测。 [应用意义] 脂肪酶是动物消化脂肪的重要酶类其分泌量和活力与动物对脂肪的消化、吸收、利用有关。水产动物肝胰脏或胰脏是脂肪酶的主要分泌器官，胃肠粘膜及肝脏亦能分泌，有的鱼类幽门垂中脂肪酶活力最高。测定水产动物各部位脂肪酶活力有助于研究、分析其对脂肪的消化能力及各部位消化功能状况。 [注意事项] 1、使用聚乙烯醇的聚合度为1000－1750，如聚合度低，乳化效果差。橄榄油乳化液在冰箱中保存三天左右仍能保持稳定。2、反应终了加乙醇可停止酶作用和溶解脂肪酸，以利滴定，乙醇用量以不低于总容量60%为宜。