基因捕获的主要分类

基因捕获载体是带有报告基因和/或选择标记基因的不完整的基因表达载体；这些载体所带的基因只有在整合到宿主功能基因内部且与融合的宿主基因编码框一致时才能得以表达。基因捕获的主要分为增强子捕获载体、启动子捕获载体、基因捕获载体三类：

一、增强子捕获载体
含有一个最小的启动子和翻译起始位点,当载体整合到顺式增强子元件附近时,此增强子将调控报告基因的表达 。对报告基因在体内表达的ES 细胞系插入位点进行克隆鉴定发现插入位置邻近编码序列。关于增强子捕获的诱变比率还未见报道,但插入的性质预示由增强子捕获产生功能失活的突变比率较低,因此,增强子捕获载体在小鼠体系中未得到广泛应用。

二、启动子捕获载体
通常由不含启动子成分的报告基因和一筛选标记基因组成,只有当载体插入到内源基因编码区序列中产生融合转录本时报告基因才可能表达 。因而启动子捕获的致突变比率很高。然而载体插入到外显子的频率非常低,捕获效率较增强子捕获至少低200倍。故载体中通常含有一个筛选标记基因,如新霉素抗性基因( neo) 或β-半乳糖苷酶(galactosidase) 与neo 的融合基因(β-GEO) ,保证载体插入的细胞克隆被筛选保留。由于插入发生在DNA 转录区,克隆插入位点就可确定突变基因。

三、基因捕获载体
中在无启动子序列的报告基因上游和下游分别含有剪接受体( splice acceptor ,SA) 和多聚腺苷酸加尾序列(polyA) ,当含有顺式作用的启动子和增强子元件被捕获基因转录激活时,载体中SA 与内源基因剪接供体( splice donor ,SD) 作用产生上游内源基因编码序列与报告基因融合转录本,使内源基因发生突变,同时报告基因的表达提示内源基因的表达特点。融合转录产物可作为克隆突变基因序列的模板。由于插入发生在内含子中,基因捕获的效率较启动子捕获至少提高50 倍。然而选择性剪接(alternative splicing) 的发生会导致低水平的野生型转录本产生而形成减效等位基因突变 。

基因捕获的基本原理
基因捕获的方法酷似以报告基因为诱饵来捕获基因。其基本过程是将一含报告基因的DNA 载体随机插入基因组,从而产生内源基因失活突变,并通过报告基因的表达激活提示插入突变的存在,及突变内源基因表达特点。通过筛选得到的插入突变的ES 细胞克隆经囊胚注射转化为基因突变动物模型,进而分析表型来研究突变基因功能。每一种ES 细胞克隆中含有不同的突变基因,在短期内可建立大量含不同基因突变的ES 细胞克隆库。突变基因的序列可通过基于PCR 的一些方法鉴定,同时还可能发现一些在体内表达或不表达的新基因。