Gibson无缝克隆总是失败

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1个载体连3个片段,都是用pcr方式扩增,能扩出正滑衡确条带,回收后还对载体DpnI酶切处理了,加入seamless混合场某斗即拉步官酶50℃反应半小时到50分钟左右,转化涂板能长满板,可就是用验证引物菌P验证没一激慧个有条带的,思来想去查了很多就是不知道问题出在哪里了明让答。请求各路大神帮忙解答一下协批未章慢曾事题握程攻,谢谢了!

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