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回答者：网友
影响外源基肠杆菌高效且性表达主要素哪些
、外源基表达效率
①启强弱效转录起始外源基能否宿主细胞高效表达关键步骤说转录起始速率基表达主要限速步骤选 择强调控启及相关调控序列组建高效表达载体首先要考虑问题
理想调控启应该：发酵早期阶段表达载体启紧紧阻遏避免现表达载体稳定细胞缓慢或由于产物表达引起 细胞死亡等问题细胞数目达定密度通种诱导(温度、药物等)使阻遏物失RNA聚合酶快速起始转录
②核糖体结合位点效性SD 序列指原核细胞 mRNA 5`端非翻译区同 16S rRNA 3`
端互补序列按统计原则般 SD 序列至少含 AGGAGG 序列 4 碱基SD 序列存原核细胞 mRNA 翻译起始至关重要
③SD 序列起始密码 AUG 间距AUG 首选起始密码GUG、UUG、AUU AUA用作起始密码非佳选择另外SD 序列与起始密码间距离 9±3 适宜
④密码组尽量避免使用罕用密码：AGG、AGA(Arg)、CUA(Leu)等
二、表达质粒拷贝数稳定性：
数情况目标基扩增程度同基表达比所基扩增提高外源基表达水平提供便于原核酵母表达体系言选择 高拷贝数质粒其基础组建表达载体表达载体稳定性维持基表达必需条件表达载体稳定性同表达载体自身特性关与受体细胞 特性密切相关所实际运用要充考虑两面素确定表达系统利用选择压力、尽量减少表达载体、通建立整合染色体载体 等待式增加表达质粒稳定性
三、表达产物稳定性：
①组建融合基产融合蛋白融合蛋白载体部通构象改变使外源蛋白选择性降解种通产融合蛋白表达外源基特别相 质量较肽或蛋白编码基尤合适
②产泌蛋白外源基表达产物泌肠杆菌细胞周质或直接泌培养基
③外源蛋白宿主细胞包涵体形式表达种溶性沉淀复合物抵抗宿主细胞蛋白水解酶降解便于纯化
④选用蛋白酶缺陷型肠杆菌宿主细胞能减弱表达产物降解
⑤采用位点特异性突变改变真核蛋白二硫键位置增加蛋白质稳定性
四、工程菌培养条件：
由于细菌100L发酵罐代谢与实验室条件200mL摇瓶代谢存差异进行工业化产工程菌株规模 培养优化设计控制外源基高效表达至关重要优化发酵程既包括工艺面素包括物面素工艺面素选择合适发酵系统或 物反应器目前应用较罐式搅拌反应器、鼓泡反应器气升式反应器等物面素包括面首先与细菌密切相关条件或素发酵系 统溶氧、pH 值、温度培养基等些条件改变都影响细菌及基表达产物稳定性物素第二面外源基表达条件优化发酵罐内工程菌 定阶段始诱导外源基表达诱导式包括添加特异性诱导物改变培养温度等使外源基特异空进行表达仅利于细胞代 谢且能提高表达产物产率物素第三面提高外源基表达产物总量外源基表达产物总量取决于外源基表达水平菌体浓度保持单 细胞基表达水平变前提提高菌体密度望提高外源蛋白质合总量
五、细胞代谢负荷：
外源基细菌高效表达必影响宿主代谢细胞代谢损伤必影响外源基表达合理调节宿主细胞代 谢负荷与外源基高效表达关系提高外源基表达水平缺少环节
