多核苷酸激酶能够把 ATP的γ-P转移到 ssDNA、dsDNA、ssRNA 或 dsRNA分子的 5 ’-OH端上。反应的方式有两种：
（1）向前反应（forward reaction）
若 DNA的 5’端是羟基，激酶直接将 ATP的γ-P转移到 DNA的 5’-OH 末端。
（2）交换反应（exchange reaction）
如果 DNA的 5’端是 P的话，则该反应需分两步走，首先在过量的 ADP 存在下，T4多核苷酸激酶将磷酸化的 DNA5’末端磷酸转移到 ADP 上，然后再从[γ-32p]ATP上将标记的γ—P转移到 DNA链上，使其重新磷酸化。
