细胞传代培养不仅是一种将细胞种保存下去的方法，而且也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。

  原理

  细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。

  传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

  用途

  1.细胞保种

  2.其他类型的细胞实验安排

  材料与仪器

  【材料】细胞

  【试剂】0.25％胰蛋白酶工作液；RPMI 1640培养基（含10％小牛血清）

  【仪器，耗材】倒置显微镜，CO2细胞培养箱、吸管、培养瓶/皿、超净工作台封口膜酒精

  步骤

  一、贴壁细胞：以HeLa细胞的传代培养为例

  1.选取生长密度80%左右即处于生长对数期的HeLa细胞，在超净工作台中操作，吸去培养皿中的旧培养基，加入1-2 mL的PBS溶液，轻轻润洗，漂洗细胞以除去残留的血清。

  2.吸去培养皿中的PBS溶液，加入1-2 mL 0.25%胰蛋白酶消化液（消化液能够覆盖细胞即可），吸弃培养基，将培养皿置37℃、5%CO2培养箱消化2～3 min(如消化程度不够，可延长时间)，倒置显微镜下观察细胞，当大部分细胞变圆且亮时，加入等体积含10%FBS的培养基终止消化。

  3.用移液枪轻柔吹打细胞使其成为细胞悬液。将细胞悬液转移到1.5ml离心管中，室温，1000 rpm，离心5 min。

  4.离心后，用吸引器轻轻吸去上清，加入1ml完全培养基重悬细胞，按照1皿细胞传2皿或3皿比例进行传代（不同细胞特性不同，分盘比例适当调整），将1皿细胞的细胞悬液一分为二或者一分为三后分别转移到新的培养皿中。

  5.接种好的细胞，应在培养皿上标记上细胞名称、细胞代数、本次传代日期和操作人姓名，轻轻摇匀后转移到37℃、5%CO2培养箱中培养。

  6.细胞培养24 h后，根据培养基的颜色及细胞的生长密度进行相应的操作（更换新鲜培养基或者再次传代处理或者进行冻存处理）。

  二、悬浮细胞或半贴壁细胞的传代培养

  悬浮细胞不贴壁（半贴壁细胞贴壁不紧），所以不需要借助胰蛋白酶消化，具体过程如下：

  1.取状态良好的细胞，在生物安全柜中操作，用移液管把细胞轻柔吹打均匀。

  2.把细胞悬液转移到15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min。

  3.轻轻吸去上清后用完全培养基重悬细胞，按照1皿细胞传2皿或3皿比例进行传代，把细胞悬液一分为二或者一分为三后分别转移到新的培养皿中。

  4.接种好的细胞，应在培养皿上标记上细胞名称、细胞代数、传代日期和操作人姓名．轻轻摇匀后转移到37℃、5%CO2培养箱中培养。

  5.细胞培养24 h后，根据培养基的颜色及细胞的生长密度进行后续相应的操作（更换新鲜培养基或者再次传代处理或者进行冻存处理）。

  注意事项

  1.把握传代时机，已如前述，在80%~90%汇合阶段最好，过早传代细胞产量少，过晚细胞健康状态不佳。

  2.消化时间要适度，消化时间过短细胞不易从瓶壁脱落，过长细胞可脱落流失。

  3.消化液浓度要适宜，过浓时消化作用强烈，细胞反应快，所需消化时间短，掌握不好，细胞易流失。

  4.各种细胞对消化反应不同，有的敏感，有的迟钝，因此应根据所用细胞特点制定适宜消化措施。有的细胞附着瓶壁不牢，用吸管可从瓶壁直接吹下来，但这样容易伤害细胞，细胞大片脱落掉，不易计数，应尽可能采用消化法分散细胞为妥。

  5.消化传代良好时，细胞受损害少，细胞悬液均匀，各分装样品中数量误差小，细胞生长增殖速度一致，实验结果可靠性大。

  6.无菌操作：细胞的整个培养过程中，无菌操作，包括操作前要洗手，进入超净台前要用75%酒精擦拭，试剂等瓶要75%酒精喷浴后才能放入超净台。

  7.操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。

  8.不同细胞，不同操作之间需要换枪头，避免污染

  常见问题

  1.吸取液体的枪头等不能混用。

  2.不能用手触碰已消毒的工作部分，工作台面上用品布局要合理