一、细胞介绍

  细胞名称：猪肾细胞LLC-PK1

  产品规格：T25培养瓶x1；1.5ml冻存管x2

  细胞数量：1x10^6；1x10^6

  保存温度：37℃；-198℃

  运输方式：常温保温运输；干冰运输

  安全等级：1

  用途限制：仅供科研3类

  培养体系：DMEM高糖培养基（Hyclone）+10%胎牛血清（Gibco）+1%双抗（Hyclone）

  培养温度：37℃

  二氧化碳浓度：5%

  简介：猪肾细胞LLC-PK1细胞源自3~4周龄的Hampshire猪肾组织，可产生纤溶酶原激活物。该细胞引种自ATCC CL-101

  注释：Doubling time:~24 hours(DSMZ).

  Derived from sampling site:Kidney.

  STR信息：/

  二、细胞收到后处理

  培养至良好状态后灌满完全培养液并封好瓶口是运输细胞的最好办法。收到细胞用75%酒精喷洒整个细胞瓶，消毒后放到超净台内严格无菌操作，将细胞瓶放入37℃、5%CO2的培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态后再做处理。显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照保存（最好40x,100x,200x各一张），前三天照片是重要售后依据，不提供照片默认收到状态良好。（传代后建议一瓶用原瓶的完全培养基，另外一瓶用自己配的完全培养基，以便进行对比培养，换液后将盖子拧松）

  三、细胞培养步骤

  a、细胞传代：如果未超过80%汇合度时，将瓶装的完全培养液收集至离心管中，留5ml完全培养基，放入37℃、5%CO2孵箱培养；如果细胞密度超80%，即可进行传代培养，传代具体步骤如下：

  1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

  2.添加1-2ml消化液（0.25%胰蛋白酶-0.53mM EDTA）至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上完全培养基终止消化。

  3.轻轻吹打细胞，使之完全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL完全培养基重悬。

  4.将细胞悬液按1：2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入到37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

  b、细胞冻存：

  1、细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃T25培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

  2、添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

  3、弃上清，沉淀细胞加入1ml的雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。

  4、将冻存细胞直接放入-80℃冰箱即可，如后期要将细胞转入液氮罐中，则需在-80℃冰箱中存放24小时以上再转入液氮罐中。

  C、细胞复苏：

  1、从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），快速将其置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁；

  2、将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；

  3、弃上清，沉淀用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养；

  4、第二天，换用新鲜完全培养基继续培养。

  四、注意事项：

  有些细胞贴壁不牢，在运输过程中容易发生细胞脱落，这是正常现象。可按此方法：将培养瓶所有培养液收集至离心管，1000rpm离心5min，收集上清作过渡培养（后期对比培养），沉淀加入胰酶1-2ml，轻轻吹打，重悬，消化1-2分钟后，加5ml完全培养基终止反应。再离心，弃上清，加1-2ml完全培养基重悬。然后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。

  参考文献

  PubMed=828141;DOI=10.1007/BF02797469

  Hull R.N.,Cherry W.R.,Weaver G.W.

  The origin and characteristics of a pig kidney cell strain,LLC-PK1.

  In Vitro 12:670-677(1976)

  PubMed=19508353;DOI=10.1111/j.1744-313X.2009.00853.x

  Ho C.S.,Franzo-Romain M.H.,Lee Y.J.,Lee J.H.,Smith D.M.

  Sequence-based characterization of swine leucocyte antigen alleles in commercially available porcine cell lines.

  Int.J.Immunogenet.36:231-234(2009)

  PubMed=20555413;DOI=10.1139/y10-023

  Gunness P.,Aleksa K.,Kosuge K.,Ito S.,Koren G.

  Comparison of the novel HK-2 human renal proximal tubular cell line with the standard LLC-PK1 cell line in studying drug-induced nephrotoxicity.

  Can.J.Physiol.Pharmacol.88:448-455(2010)