荧光染料是一类能够吸收光能后发出可见光的材料，其发光原理是基于染料内部的原子或分子在吸收特定波长的光能后被激发至高能态，当电子从高能态返回基态时，以光子的形式释放出能量，从而产生荧光信号。荧光染料作为荧光标记与染色物质，在生物成像、疾病诊断、治疗监测、环境监控和化学传感等领域具有广泛的应用。

荧光染料在细胞凋亡研究中扮演着至关重要的角色，提供了从早期到晚期、从定性到定量的多维度检测手段，其核心价值在于能够非侵入性或低侵入性地、实时动态地揭示凋亡过程的特异性生化与形态学事件。

细胞凋亡是一个高度调控的细胞死亡过程，是各种生理过程的重要组成部分，包括正常细胞更新、免疫系统的正常发育、激素依赖性萎缩、胚胎发育和化学诱导的细胞死亡。不适当的细胞凋亡是许多人类疾病的一个因素，包括神经退行性疾病、缺血性损伤、自身免疫性疾病和许多类型的癌症。随着细胞凋亡成为研究的焦点，细胞凋亡的巨大治疗潜力使研究人员能够开发出有前途的治疗解决方案，专注于异常细胞的自愿死亡。

本文从凋亡特征、技术原理、各种方法的应用范围等方面，总结了细胞凋亡检测技术在生命科学领域的应用，为更好地筛选和确定合适的细胞凋亡检测方法提供了参考。

形态学特征

细胞凋亡伴随一系列形态学变化：胞膜出现小泡、细胞体积收缩、核质浓缩、染色质凝聚并最终DNA降解，形成大量凋亡小体被邻近巨噬细胞吞噬。依据核形态可分为三期：I期细胞萎缩、胞质致密、含水量下降、表面微绒毛消失，细胞与周围组织分离；IIa期染色质凝聚成致密团块或沿核膜内侧聚集（边缘化），随后核碎裂；IIb期细胞骨架降解导致膜内陷或芽状突起，形成包裹细胞质、核碎片及细胞器的凋亡小体。

细胞凋亡过程

生化特征

除了形态学特征的改变，细胞凋亡还涉及一系列生化特征的变化，如DNA的片段化、细胞凋亡蛋白caspase的激活及细胞膜表面磷脂酰丝氨酸(PS)的外翻等。线粒体在细胞凋亡的整个过程中是不可缺少的一部分，它们的状态对细胞凋亡的调节至关重要。Bcl-2家族蛋白广泛存在于线粒体膜上，它与线粒体的结合状态将会引起一系列的生化反应：从线粒体膜电位的变化，到细胞色素C的释放，再到caspase通路的激活。找到细胞凋亡过程中生化指标的改变，并基于这些变化设计对应的检测方法，是鉴定细胞凋亡的一种有效策略。

DNA片段的检测分析

DNA的片段化是细胞凋亡发生的一个特征性的生化指标，可以作为细胞凋亡的标志。细胞凋亡时，细胞内的特异性核酸内切酶会被活化，并使染色质DNA在核小体间被特异性切割，DNA降解成180~200 bp或其它整数倍片段。从而产生大量的3'-OH粘性末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素等形成的衍生物标记到DNA的3'-OH末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。

TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

TUNEL示意图

线粒体膜电位的检测

线粒体膜电位的变化发生在其形态特征改变之前，该事件发生在细胞凋亡早期，基于此现象可以设计细胞凋亡检测方法。用荧光亲脂性阳离子染料，如 JC-1，染色细胞和组织，荧光信号的增强或减少可以反映线粒体的膜电位变化。当细胞内的线粒体由高膜电位状态向低膜电位状态转换时，染料会从聚集在线粒体基质内的聚合物状态转换成存在于细胞质中的单体形式，从红色荧光转变成绿色荧光。红色荧光信号和绿色荧光信号之间的转换反映了细胞内线粒体膜电位的高低变化，两者的相对比值通常可以用于衡量线粒体去极化的比例，绿色荧光较强说明细胞发生了基于线粒体通路的早期凋亡。

PS外翻的检测

细胞凋亡早期位于胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）会翻转到细胞膜外表面。基于此现象，人们采用了Annexin V法检测细胞凋亡。该法利用了Annexin V能与PS高亲和特异性结合的特点，Annexin V分子量为35 kD，属于膜联蛋白家族中的一类，在Ca2+存在情况下，当位于胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸翻转到胞膜外侧时，Annexin V能够特异性识别并结合到PS上。而在正常或坏死的细胞中，PS这种外翻现象却不会发生。

检测早期的细胞凋亡以Annexin V-FITC染色为主，将Annexin V进行荧光素（FITC）标记，以标记了的Annexin V为荧光探针，利用流式细胞仪或者荧光显微镜即可检测到细胞凋亡的发生。晚期凋亡细胞则采用Annexin V-FITC/PI双染色。碘化丙啶（propidine iodide, PI）为一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但PI可以透过凋亡中晚期及死细胞的细胞膜而使细胞核染成红色。因此，若将Annexin V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞及凋亡晚期和死细胞区别开来。

流式细胞仪结果图

荧光显微镜结果图

Caspase-3活性的检测

细胞凋亡过程中有许多蛋白酶参与并相互协调以促进凋亡的发生。在凋亡的起始和执行过程中起关键作用的是半胱胺酸天冬氨酸酶（Caspases），此酶在促进凋亡因子刺激下活化，对底物进行特异性水解，通过切断与周围细胞的联络、重组细胞骨架、关闭DNA复制、修复和破坏DNA及核结构而直接参与凋亡的早期启动，并将活化信号传递下去形成一个Caspase级联反应。大多数凋亡都涉及Caspase-3的活化，它通过分解去除DNA酶的一个负调节亚基而间接使之活化，实现了DNA的片段化，最终发生细胞凋亡。至今在细胞坏死中未发现Caspase的活化，Caspase的失活可能使细胞从凋亡转入坏死，因此检测细胞中Caspase的活力可以作为区分凋亡和坏死的一个标准。结合荧光显微镜和流式细胞仪分析，将会对凋亡细胞作较为准确的定性和定量检测，灵敏度高、特异性强。

ApopView™ 488 Caspase-3 Substrate基于caspase-3/7活力检测细胞凋亡，适用于荧光显微术和流式细胞术。Substrate由耦合Ccaspase-3/7 DEVD识别序列的荧光DNA染料组成。Substrate最初无荧光，穿过细胞膜进入细胞质，在凋亡细胞中，Caspase-3/7剪切Substrate，释放高亲和性的DNA染色，这种染料迁移到细胞核标记DNA并发出明亮的绿色荧光。因此，ApopView™ 488 Caspase-3 Substrate是双功能的，既可以检测Caspase-3/7活性，又可视化细胞核在细胞凋亡进行中的形态学变化。

ApopView™ 488 Caspase-3 Substrate提供DMSO和PBS两种溶解形式。PBS形式可用于对DMSO毒性敏感的细胞，在对DMSO不敏感的细胞类型中，添加DMSO溶解形式可增强ApopView™ 488的孵育染色效果。

Ca2+水平检测

细胞内钙离子检测是研究细胞信号传导、生理功能及病理状态的核心技术之一，其核心是通过特定方法捕捉细胞内游离钙离子（Ca²⁺）的浓度变化，进而揭示Ca²⁺在细胞活动中的调控作用。Ca2+检测是信号转导G蛋白偶联受体（GPCR）介导的相关药物筛选以及其他相关实验中非常重要的一种研究手段。

Fluo‑3、Fluo‑4、Fluo‑8、Fluo‑20均为可见光激发的荧光钙指示剂，以AM酯（acetoxymethyl ester）‍形式提供，能够被动渗透活细胞，进入细胞后被酯酶水解成为带有羧基的荧光染料，只有在与Ca²⁺结合时荧光强度才会显著提升，从而实现对细胞内钙浓度的实时监测。

Fluo-20 AM

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