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DNA 5’末端标记试剂盒

价格：￥1

品牌：xuanya

产地：中国/美国

最新更新日期：2021-07-12 14:17

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上海烜雅生物科技有限公司

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产品属性

保存条件

常温运输和保存

保质期

两年

英文名	DNA 5’ End-Labeling Kit

数量

890

供应商	上海烜雅生物科技有限公司

规格

10 次

产品说明

DNA 5’末端标记试剂盒产品及特点：
本产品为DNA5’末端标记系统，利用T4PolynucleotideKinase（T4多聚核苷酸激酶）和［γ-32P］ATP对粘性末端或平末端的DNA或RNA的5’末端进行高效标记反应。原理如下：

DNA 5’末端标记试剂盒本产品具有下列特点：
1.使用本试剂盒之前，不需要对5’末端的磷酸基团进行去磷酸化处理，因为使用的kinase能使5’末端的磷酸与[γ-32P]ATP的γ-磷酸进行交换。
2.合成的单链或双寡核苷酸的5’末端游离的OH基团都能通过Kinase反应被标记（或者只是简单的磷酸化）。
3.提供的两种反应液使交换反应和磷酸化反应都能高效进行，均能得到大于106cpm/pmol（5’-end）的比活性。

DNA 5’末端标记试剂盒运输及保存：
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：DNA片段、［γ-32P］ATP或其它的标记、未标记的ATPs、牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）等

DNA 5’末端标记试剂盒使用方法
一、交换反应
1.实验前需自备的试剂：7M醋酸铵、100%乙醇、70%乙醇等
2.在微量离心管中制备下列反应液：

DNA 5’末端标记试剂盒注：5pmoles的5’末端约等于0.17μg的长100bp的双链DNA。
3.37℃反应30分钟。
4.70℃加热5～10分钟使酶失活。
5.加入10μL的7MCH3COONH4（pH4.5）。如使用CH3COONa做乙醇沉淀时使其终浓度达300mM。
6.加入87.5μL（2.5倍）的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。
7.离心回收沉淀，用70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
8.用适当Buffer溶解沉淀。注：通过第5～8步操作几乎可以除去大部分未反应的[γ-32P]ATP，如要完全将其除去时，乙醇沉淀后用凝胶过滤等方法精制即可。如需用抽提除去蛋白质时，请在第8步之后进行。

DNA 5’末端标记试剂盒二、磷酸化反应标记
A.去磷酸化反应
1.实验前需自备的试剂：TE饱和酚/氯仿、3MNaCl、100%乙醇、70%乙醇、牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）等
2.在微量离心管中制备下列反应液：

3.50℃反应30分钟。
4.加入150μL的TE饱和酚/氯仿/（25：24：1），充分混匀。
5.离心，取上层（水层）移到另一个微量离心管中。
6.重复操作4～5。
7.加入7.5μL的3MNaCl（最终浓度150mM）。
8.加入375μL（2.5倍量）的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。
9.离心回收沉淀，用1mL70%的冷乙醇清洗后，沉淀真空干燥。
10.使用20μL的TEBuffer溶解沉淀。

DNA 5’末端标记试剂盒B.磷酸化反应（前反应）
1.在微量离心管中制备下列反应液：

2.37℃反应30分钟。
3.下面的操作与交换反应的第4-8步操作相同。

DNA 5’末端标记试剂盒三、合成DNA寡核苷酸的标记
1.在微量离心管中制备下列反应液：

2.37℃反应30分钟。
3.下面的操作与交换反应的第4-8步操作相同。

DNA 5’末端标记试剂盒四、合成DNA寡核苷酸的标记当掺入水平很低的时候，需要使用本步骤，即通过体积排阻色谱或过滤试剂盒除去未反应的标记。SephadexG-50层析柱（需另购）对于去除未掺入的dNTPs效果很好，它还能大幅减少小于20个碱基的DNA寡核苷酸和小于20bp的双链DNA的量。使用之前需要在70℃加热5～10分钟以使T4多聚核苷酸激酶失活。SephadexG-25层析柱可以用来纯化长度不小于10个碱基的寡核苷酸。

DNA 5’末端标记试剂盒使用举例
按照使用方法中交换反应和合成DNA寡核苷酸的标记的实验操作，取λ-BstPI，λ-HpaI，λ-EcoT22I各3pmols，用［γ-32P］ATP通过正向磷酸化反应或交换反应标记。各DNA片段的放射自显影结果如下所示：

DNA 5’末端标记试剂盒注意事项
1.缓冲液可在室温融解。融解后立即置于冰中，使用前充分混匀。
2.5×交换反应缓冲液于-20℃冻结保存时会有白色浑浊出现，但不影响反应效果。
3.酶切得到的DNA片段需经乙醇沉淀等方法纯化。
4.当用于交换反应的DNA在5pmoles以上（约1,000bp以上）时，标记效率有时会低于106cpm/pmol。
5.如果交换反应所用DNA低于500bp时，标记效率有时会有所降低。
6.若不进行放射线标记，仅使用本试剂盒做5′末端磷酸化反应时，反应体系中的［γ-32P］ATP可用5μL的10mMATP代替。
7.磷酸化反应时的［γ-32P］ATP可用［γ-35S］ATP替代。

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