一、实验内容

1．重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。

2．重组蛋白的Western boltting鉴定。

二、实验要求

通过实验，要求学生掌握外源基因在原核细胞中表达的方法，掌握Western bolt的基本原理、实验操作步骤及注意事项。

三、实验方法

1．重组蛋白的原核表达与SDS-PAGE分析
（1）将含有重组质粒的细胞在LB平板（含抗生素）上划线，37℃培养过夜。
（2）从LB平板挑取单菌落分别移至2 mL的LB培养液（含抗生素），37 ℃振荡培养过夜。
（3）将过夜培养物按1：100转接于2 mL的LB培养液（含抗生素），37℃继续振摇培养至细菌生长对数中期（OD₆₀₀ 值达0.5～0.6）。

（4）加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L，37℃诱导表达3～6 hr。
（5）取200 μL菌液装入1.5 mL Eppendorf管中，以5000 rpm离心1 min，得到菌体细胞。将细胞重悬于30 μL水，再加入10 μL 4 × SDS-PAGE加样缓冲液，混匀，100℃煮沸10 min后，12,000 rpm离心2 min，吸取上清转移至另一新的离心管中。

（6）样品取5~10 μL进行SDS-PAGE分析。

2．Western blot分析

（1）取4 μL阳性克隆诱导后的样品，利用15%SDS-PAGE电泳分离。

（2）用半干式电转移法将蛋白转至NC膜上。

a. 将聚丙稀酰胺凝胶浸泡在电转移缓冲液中平衡10 min。

b. 裁剪与凝胶大小相同的NC膜，在电转移缓冲液中平衡10 min。

c. 裁剪合适大小的滤纸，用电转移缓冲液浸润，按阳极、三层滤纸、NC膜、凝胶、三层滤纸、阴极的顺序叠放电转移三明治。

d. 按0.5 mA/cm²膜恒流电转移30～50 min。

（3）杂交

a. 将NC膜在5%脱脂奶封闭液中室温反应1 hr。

b. TBST漂洗3 × 10 min

c. 转移膜至用TBST1：100稀释的一抗工作液（抗六个组氨酸单克隆抗体）中，室温反应1 hr。

d. TBST漂洗3 × 10 min

e. 转移膜至用TBST1：2000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的羊抗兔IgG二抗工作液中，室温反应1 hr。

f. TBST漂洗3 × 10 min。

（4）显色

将膜浸泡在DAB显色液中，待出现清晰条带后，把膜转移至蒸馏水中中止反应。

（5）拍照和保存结果。

附：

溶液配制

电转移缓冲液

48 mmol/L Tris
39 mmol/L 甘氨酸

0.01% SDS

20% 甲醇

TBST
20 mmol/L Tris-HCl/pH 7.5
0.15 mol/L NaCl
0.05% Tween-20

Western blot封闭液：TBST + 5%脱脂奶粉或胎牛血清白蛋白

抗体稀释液：TBST + 1%脱脂奶粉或胎牛血清白蛋白

DAB显色液：二氧基联苯胺，Diaminobenzidine


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