Wehelp （Golden）Eva Mixture是专用于染料法（Eva Green）实时荧光定量 PCR的预混体系，浓度为2×，包含（Golden）Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、Eva Green荧光染料和Mg²⁺。配制好的预混合液操作简单便捷、能有效缩短操作时间，减少移液过程中混入的污染。
Eva Green染料是一种核苷酸荧光染料，有较好的热稳定性与水解特性，更加便利地用于各种扩增，包括qPCR、熔解曲线分析、高分辨率熔解曲线分析（HRM）、常规溶液的DNA量化及毛细管电泳等，适用于各种仪器设备。与SYBR Green Ӏ 能快速通过细胞膜提高突变性不同的是，Eva Green染料不能穿透细胞膜，因此不具突变性与细胞毒性。
Molebio-006中使用了全新高效的Taq DNA Polymerase与Wehelp独特配制的PCR缓冲体系，Taq DNA Polymerase具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性，PCR反应能灵敏度高、特异性强。EvaGreen优势（与SYBR Green Ӏ相比）

• 能有效抑制非特异性扩增。
• 采用更高浓度的染料，荧光信号更强。
• 高浓度的Eva Green能有效减少PCR反应末端常见的染料重新分布问题，熔解曲线分析更加精确。
• 优化qPCR反应和熔解曲线分析，产量高、重复性好。
• 适用于荧光定量PCR检测，能够准确地对目的基因进行定量和检测。

注意事项

• -20℃避光保存，避免污染。

• 避免反复冻融，反复冻融可能使产品性能下降。

• 使用前，需上下轻轻颠倒混匀，防止染

料吸附在瓶壁上，经短暂离心后使用。

• 在荧光定量PCR仪上进行实时PCR，并在退火或延伸步骤记录荧光信号。
• 本产品未添加ROX校正染料。
• 本产品不能用于探针法荧光定量PCR。

PCR反应体系

试剂	50 μl 反应体系	终浓度
2× (Golden) Eva Mixture	25 μl	1×
10 μM Forward Primer	1 μl	0.2 μM (0.05-1 μM)
10 μM Reverse Primer	1 μl	0.2 μM (0.05-1 μM)
Template DNA	2 μl
ddH2O	to 50 μl

PCR循环反应条件

步骤	循环次数	温度	时间
1	1	96℃	2分
2	35~40	95℃	15 秒
		60~64℃ (信号采集点)	1分
3	1 (熔解曲线)	95℃	15秒
		60℃	1分
		95℃	15秒
		60℃	15秒

反应条件优化

• 引物浓度：一般以引物浓度0.2 μM为最佳浓度，终浓度0.05-1.0 μM为参考范围。降低引物浓度提高反应特异性；增加引物的浓度提高扩增效率，优化反应体系。

• 退火温度：升高退火温度是常用的提高反应特异性的方法，以60-64℃作为参考范围。若因Tm值较低引起实验结果不佳，可采用三步法进行PCR扩增，退火温度的参考范围为56℃-64℃。
• 延伸时间：推荐使用两步法PCR，延伸时间设置为1 min。若提高扩增效率，可将延伸时间增加，或尝试三步法PCR。

三步法荧光定量PCR

步骤	循环次数	温度	时间
1	1	96℃	2分
2	35~40	95℃	15 秒
		56~64℃	30秒
		72℃ (信号采集点)	32秒
3	1 (熔解曲线)	95℃	15秒
		60℃	1分
		95℃	15秒
		60℃	15秒

联系方式
电 话：0523-86201335
产品咨询：8010 技术咨询：8007
传 真：0523-86201325
邮 箱：sales@wehelpinc.com
地 址：江苏省泰州医药高新区药城四期G75栋2层