一、试剂盒说明
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（ PS ）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（ PS ）由脂膜内侧翻向外侧。 Annexin V 是一种分子量为 35~36kD 的 Ca²⁺ 依赖性磷脂结合蛋白 ，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此 Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将 Annexin V 进行荧光素 PE 标记，以标记了的 Annexin V 作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
7-AAD （7-amino-actinomycin D）是一种核酸染料，它不能通过正常质膜，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，质膜对7-AAD的通透性逐渐增加，结合细胞凋亡中DNA的有控降解，在合适波长激发光的激发下可发出明亮的红色荧光，通过7-AAD标记DNA的强弱，将细胞分为三群：7-AAD强为死亡细胞，7-AAD弱是凋亡细胞，7-AAD-为正常活力细胞。7-AAD同PI 有着相似的荧光特性，但其发射波谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI 的最佳替代品，可与Annexin V- PE联合使用。
本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（ 不推荐用于检测组织样本 ）。
二、试剂盒组份

组份	Cat: KGA 10 assays	Cat: KGA 20 assays	Cat: KGA 50 assays	Cat : KGA 100 assays	储存条件
AnnexinV-PE	50 μ L	100 μ L	250 μ L	500 μ L	4 ℃ 避光
7-AAD 染液	50 μ L	100 μ L	250 μ L	500 μ L	4 ℃ 避光
Binding Buffer	5 mL	10.0 mL	25 mL	50 mL	4 ℃

三、试剂盒以外自备仪器和试剂
流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、微量移液器
1.5m L Microtube 、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、 PBS 、不含 EDTA 的胰酶消化液
四、使用注意事项
1． 微量试剂取用前请离心集液。
2． Annexin V-PE/ 7-AAD 避光保存及使用。
3． 7-AAD 为潜在致癌物，操作时请采取防护措施，穿防护服、戴手套等。
4． 本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于 1×10^5， ，不推荐用于检测组织样本。
5． 推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，建议适用不含 EDTA 的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含 2%BSA 的 PBS 中，防止进一步的损伤。
6． 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。
7． 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。


五、操作方法
1． 悬浮细胞离心（ 2000rpm 离心 5min ）收集；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶 消化收集（注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性）；
2． 用 PBS 洗涤细胞二次（ 2000rpm 离心 5min ）收集 1~5×10⁵ 细胞；
3． 在 50 μ L 的 Binding Buffer 中加入 5 μ L 7-AAD 染液 ，混匀；
4． 收集细胞中加入 上述 7-AAD 染液 ，混匀；室温、避光、反应 5 ～ 15min ；
5． 反应后再加入 450 μ L 的 Binding Buffer 混匀；
6． 加入 1 μ L Annexin V-PE 混匀；室温、避光、反应 5 ～ 15min ；
7． 请在 1 hour 内，进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。
A． 荧光显微镜观察
1． 滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞；
2． 对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；
（1） 将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；
（2） 用 PBS 洗涤细胞两次；
（3） 在 500 μ L 的 Binding Buffer 中加入 1 μ L Annexin V-PE ， 5 μ L 7-AAD 染液 混匀；
（4） 将上述溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖；
（5） 避光、室温反应 5 min 。
3． 将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下滤光片（罗丹明）观察 Annexin V-PE 荧光信号呈橙红色； 激发波长546nm，发射波长647 nm ，观察 7-AAD 荧光信号呈红色。
B． 流式细胞仪分析
用流式细胞仪检测，激发波长 Ex=488 nm; 发射波长 Em=578 nm ， Annexin V- PE 的橙红色荧光建议使用 FL2 通道检测； 激发波长 Ex=546 nm; 发射波长 Em=647 nm ， 7-AAD 红色荧光建议使用 FL3 通道检测。
荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。
六、 凯基相关产品（详见凯基网站 http://www.keygentec.com.cn ）
细胞株、细胞提取物及细胞培养产品
¨ 人类肿瘤细胞株 鼠肿瘤细胞株 正常细胞株 肿瘤耐药细胞株
¨ 细胞提取物（RNA/DNA/蛋白） 细胞培养相关产品
细胞凋亡
一、细胞凋亡研究试剂盒
¨ Annexin V-FITC/ EGFP/PE 细胞凋亡检测试剂盒
¨ TUNEL 凋亡原位检测系列试剂盒
¨ Caspase(2 、3、6、8、9)系列细胞凋亡检测试剂盒
¨ 线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1） TRAP-PCR端粒酶活性检测试剂盒 DNA Ladder检测试剂盒
二、细胞凋亡相关抗体 三、凋亡诱导剂、抑制剂
四、氧化应激损伤检测试剂盒 五、细胞凋亡研究辅助试剂
细胞增殖/毒性/活力与细胞周期
凯基细胞周期检测试剂盒 MTT 、XTT、WST-1、CCK-8等系列细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒
细胞染色产品
活细胞/凋亡细胞/坏死细胞鉴别试剂盒（AO/EB法.荧光显微镜） 凯基细胞凋亡形态学检测试剂盒
罗丹明123、DAPI、PI、 7-AAD 、Hoechst 33258、EB、吖啶橙染色试剂盒
亚细胞组分制备
¨ 细胞核、线粒体制备试剂盒 □ 细胞悬液制备试剂盒（组织消化试剂盒）