CLIP-seq概念：

其主要原理是基于RNA分子与RNA结合蛋白在紫外照射下发生耦联，以RNA结合蛋白的特异性抗体将RNA-蛋白质复合体沉淀之后，回收其中的RNA片段，经添加接头、RT-PCR等步骤，对这些分子进行高通量测序，再经生物信息学的分析和处理、总结，挖掘出其特定规律，从而深入揭示RNA结合蛋白与RNA分子的调控作用及其对生命的意义。

应用范围：

 RNA结合蛋白作用机制研究

 lncRNA/circRNA功能机制研究

 miRNA靶标鉴定

技术优势：

 准确性高：从活细胞交联开始，反应了体内环境下真实的分子间相互作用。

 特异性强：紫外辐射不会造成蛋白和蛋白之间的交联，只会鉴定出蛋白和 RNA 之间的相互作用。

 应用范围广：特别适用于研究剪接因子RNA结合图谱、miRNA作用靶点等研究。

实验流程

 1、3"adaptor连接

 2、5"adaptor连接

 3、第一链cDNA合成

 4、PCR扩增

 5、片段大小选择

 6、文库质检

 7、Hiseq 2500高通量测序

 8、生物信息分析

测序模式：

HiSeq 2500单端1X50bp测序模式

20M clean reads

标准数据分析

1、去除接头序列及低质量reads的处理

2、测序质量评估

3、序列比对

4、测序reads全转录组分布图

5、结合峰鉴定

6、结合峰基因元件分布

7、差异结合峰检测

8、差异结合峰相关基因GO功能富集分析

9、差异结合峰相关基因KEGG生物通路富集分析

10、个性化数据分析

11、结合峰的motif检测

案例解读一：

研究者采用了CLIP-Seq方法全面获得hnRNP U基因组范围内的结合图谱，发现hnRNP U不直接结合SMN2上关键的7号外显子及周围intron区域，却直接结合U2 snRNA的SmBP-box区域。因此，hnRNP U可能通过参与U2 snRNP 的相互结合而被招募到组成型 3" 剪接位点的附近，与U2AF65相互作用。

案例解读二：

Argonaute 蛋白（Ago1和Ago2）是miRNA沉默效应蛋白复合物（miRNPs）的组成部分。本研究通过RIP-Seq技术，对人结肠癌细胞系在正常状态和低氧条件下Ago1 和Ago2蛋白共沉淀的miRNA 和mRNA关联体进行进行差异分析和功能注释。通过对比发现结合Ago1和Ago2的miRNA共享度较高，而mRNA功能存在明显差异。

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