冰冻切片步骤：

1、组织固定：新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上。将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整。

2、脱水：将修切好的组织放于15%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底后转入30%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底。

3、Oct包埋：将脱好水的组织取出用滤纸将表面水稍吸干后切面朝上放于包埋台上，组织周围滴上OCT包埋剂，将包埋台放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，OCT变白变硬后即可进行切片。

4、冰冻切片：将包埋台固定于切片机上，先粗切将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚度6-8μm。将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。-20°保存备用。

注意事项：

一、组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：

1、CO2气（-78℃）

2、 丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（-80℃）

3、 液氮（-190℃）

4、 液氮冷却的丙烷（-19℃）。液氮适用于组织化学，较安全。缺点：组织块易发生龟裂。

二、为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。故不宜使用，低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢酶。

三、电镜出现后，需要保存细胞的超微结构，以4%缓冲戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7.）84ml；蔗糖8g）固定较好。这些固定液主要用于水解酶，而不适于许多氧化还原酶和转移酶。