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转录组测序及分析一、技术介绍转录组一般指活细胞在特定状态下所有RNA的总和，包括mRNA、tRNA、miRNA、rRNA等。转录组测序主要针对mRNA进行高通量测序。无需物种基因组信息，快速获得任意物种在特定组织和状态下全局的表达信息。 |
| 二、技术策略 1.文库制备 mRNA回收：用poly T磁珠富集回收mRNA, 原核生物用试剂盒去除rRNA后，回收mRNA 文库类型：常规文库、DSN均一化文库、链特异性文库 2.测序方案 测序平台：Hiseq2000,Hiseq2500, 测序类型：双末端测序，PE100 数据量：真核推荐不少于4G, 原核推荐不少于1G 三、技术路线 |
四、生物信息分析1.有参考序列1.1测序数据质控及评价 去测序接头污染，并统计比例 去低质量序列并统计比例 去rRNA序列并统计比例 基因组覆盖度及测序随机性评估 1.2.基因表达分析 基因表达量计算（tpm、fpkm、rpkm） 差异表达基因分析（log2>1, fdr<0.001） 差异基因的表达模式聚类分析(样品间聚类、基因间聚类) 差异表达基因GO功能富集分析 差异表达基因KEGG代谢通路富集分析 1.3.高级分析 基因结构优化 可变剪接及新转录本鉴定 SNP、InDel分析 差异表达基因蛋白互作网络分析 2.无参考序列 2.1.测序数据质控及评价： 去测序接头污染，并统计比例 去低质量序列并统计比例 2.2.Unigene分析 组装结果分析（contig及unigene分析） Unigene功能注释（COG、GO、KEGG数据库分类分析） 预测CDS 2.3.Unigene基因表达分析 基因表达量计算（tpm、fpkm、rpkm） 差异表达基因分析（log2>1, fdr<0.001） 差异表达基因GO功能富集分析 差异表达基因KEGG代谢通路富集分析 2.4.高级分析 SNP 分析 SSR开发及引物设计 差异基因蛋白互作网络分析 五、技术优势 1.直接测定转录本片段、单碱基分辨率； 2.高灵敏度，检测稀有转录本； 3.无需基因组信息，直接对任何物种转录组测序分析； 六、案例分析 Transcriptome-based discovery of pathways and genes related to resistance against Fusarium head blight in wheat landrace Wangshuibai. [BMC Genomics,2013] 文章中,研究者利用转录组de novo技术获得小麦抗禾谷镰刀菌品种Ｗangshuibai基因集、并结合数字 基因表达谱技术研究了Ｗangshuibai及其抗性突变株NAUH117。鉴定了与抗性相关的基因和代谢通路。 1、实验设计 通过转录组denovo测序获得抗病品种望水白的基因集，并利用NR，GO,KEGG,Swiss-Prot等数据库进 行功能注释。在此基础上，用数字基因表达谱技术在侵染24和48小时分别测定望水白及其敏感突变株 NAUH117基全局基因表达情况，鉴定抗性基因 2. 实验结果 |
| 七、常见问题 1.转录组测序对样品有要求？ 答： 1）组织样品需大于2g, 植物材料应尽量选细嫩部位 2）采样后需用液氮速冻，保存于-80℃，使干冰运输 3）送样管需标清样品，用Parafilm膜密封，并与送样单信息对应 4）样品保存期间切忌反复冻融 5）RNA 样品用Alilent2100 Bioanalyzer 检测RIN值需在8.0以上 2. 转录组测序时，有参考序列和无参考序列对应的分析有哪些区别？ 答：1）有参考序列时，会将测序数据与参考序列比对，统计Reads在基因组上的分布，评估测序随机性 。无参考序列时会将测序Reads组装得到Unigene。 2）有参考序列时，会进行新转录本预测，可变剪切鉴定。无参考序列时会对Unigene进行CDS预测 和功能注释，并开发SSR标记。 3）无参考序列分析消耗较多资源成本较有参考序列相对较高 |
