瑞晶生物科技有限公司
酵母表达系统
一、目的基因全基因合成：
1.从基因库中搜索目标蛋白的cDNA序列（或客户直接提供）；
2.根据选用的表达系统对cDNA进行密码子，mRNA二级结构等的优化；
3.合成设计好的基因序列。
交付标准：目的基因及测序报告。
时间：2-3周
二、 目的基因亚克隆：
1.扩增并抽提含有目的基因的载体质粒；
2.将目的基因亚克隆到合适的表达质粒上；
3.测序验证构建质粒的准确性；
4.可提供表达载体：pPICZαA/B/C和pPIC9K。
交付标准：正确构建的重组表达质粒，含重组质粒的菌株及测序报告。
时间：2-3周
三、表达菌株电转化：
1.酶切线性化表达质粒；
2.将表达质粒通过电转化整合到高效的酵母表达菌株中；
3.通过PCR鉴定至少挑选5个阳性克隆；
4.可提供表达菌株：X33，GS115，KM71和SMD1168。
交付标准：PCR阳性克隆及PCR结果报告。
时间：2周
四、表达菌株筛选：
1.将5个阳性克隆于BMGY培养基中扩增，然后换至BMMY培养基中，并加入甲醇诱导表达目的蛋白。
2.SDS-PAGE电泳检测培养上清中目的蛋白的表达情况，并挑选合适的单克隆菌株用于目标蛋白的表达
3.如果培养上清中检测不到表达，则通过将上清浓缩20倍作用再检测，或通过Western-blot方法检测目标蛋白表达（客户需要提供相关抗体）。
交付内容：阳性克隆菌株及表达筛选结果报告。
时间：2-3周
五、表达菌株表达条件的优化：
1.挑选20个阳性克隆进行常规表达筛选，并对其中表达最好菌株优化表达条件；
2.对挑选出来的单克隆菌株，优化培养及诱导条件（培养基，菌体密度，甲醇浓度，诱导时间等），提高目的蛋白的表达量。
交付标准：三个阳性克隆菌株及优化表达条件结果报告。
时间：2周
六、 目的蛋白表达及纯化：
1.摇瓶培养1L重组酵母菌，诱导表达目的蛋白；
2.通过亲和、离子交换、疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白；
3.通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。
交付标准：纯化好的目标蛋白1~2mg及纯化报告，纯度最高可达85%-90%以上。
