以下以直径60mm培养皿培养的细胞转染为例
1.在转染前一天把约2.5×105细胞传代到直径60mm的培养皿,待第二天达到约2.5×105细胞(70-80%)时转染。
2.上下倒置数次或vortex混匀脂质体转染试剂,取60微升加到1毫升无血清的DMEM培养液中后,再加5微克的DNA,轻轻混合后在室温中放置15-30分钟。
3.移去细胞培养皿中的含10%血清的DMEM培养液,加入1毫升不含血清的DMEM培养液和步骤3准备的1毫升DNA和脂质混合物,在37oC细胞培养箱内放置4小时后,再加入2毫升含有10%血清的DMEM培养液,5-6小时后,吸除含有LipoFu2008-DNA的培养液,加入适量的新鲜细胞培养液继续培养。
注1:最佳的转染条件,因具体的细胞和培养条件而定,LipoFu2008(毫升):plasmid DNA(微克)的量可在6:1-18:1范围内自行优化转染条件。对于多个孔转染相同数量相同质粒的情况可以把每个孔所需的LipoFu2008和DNA混合物配置在一个离心管内,混匀孵育后可分加到各个孔中。
注2:对于其它培养板或培养器皿,各种试剂的用量可以按照细胞培养面积按比例进行换算,具体参照表1。
注3:室温孵育15-30分钟,可能出现絮状漂浮物,属正常现象,不会影响转染效率。无论是贴壁细胞还是悬浮细胞,LipoFu2008-DNA混合物全部加入后需轻轻混匀。
注4:转染后5-6小时不更换细胞培养液对大多数细胞无明显毒性,更换培养液对一些细胞可以提高转染效率。
对于基因表达,再培养24-48小时后即可检测转染效果;如果用于筛选稳定表达细胞株,则在转染后24-48小时即可加入适当的筛选药物,例如G418等,进行稳定表达细胞株的筛选。